中国预防兽医学报 /oa 2016年~2017年我国华北地区某规模化猪场<br />经典美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及<br />全基因组序列分析<br /> /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170901 &nbsp;为了解近期我国华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及变异情况,本研究对该地区某猪场采集33份2016年~2017年疑似患PRRS猪病料样品进行PCR检测,对阳性样品进行病毒分离,并从分离株中选择两株病毒(SD158和SD192)进行全基因的序列扩增及分析。结果显示,检测到13份PRRSV阳性病料样品,病原为经典美洲型PRRSV,但仅分离到11株病毒(4株感染MARC-145细胞,另外7株感染PAM细胞)。SD158和SD192株与RespPRRS MLV株(疫苗株)的核苷酸同源性最高,分别为99.7 %和99.4 %。对这两株PRRSV与VR-2332、RespPRRS MLV的各基因的推导氨基酸序列进行分析,结果显示在VR-2332与RespPRRS MLV株22处差异氨基酸中,SD158株有15处、SD192株有14处氨基酸和RespPRRS MLV株相同,但二者仅各有6处及7处氨基酸与VR-2332株一致,在鉴别PRRSV VR-2332株与RespPRRS MLV株的7处可能与毒力相关的氨基酸位点时发现,SD158与SD192株各有5处基酸与VR-2332株相同。根据以上结果推测SD158与SD192株可能来源于PRRSV RespPRRS MLV株,具有上述分子变化特征的PRRSV在我国的流行状况值得关注。<br />   2017年09月12 00:00 2017年09 691 696 0 刘春晓<sup>1*</sup> ,张洪亮 <sup>1* </sup>,张文立<sup> 1</sup> ,相丽润<sup> 1</sup> ,李真<sup>1 </sup>,冷超粮<sup> 2</sup> ,陈家锃 3 ,彭金美<sup> 1 </sup>,<br />王 倩<sup>1 </sup>,安同庆 <sup>1 </sup>,童光志<sup> 4*</sup> ,蔡雪辉<sup> 1* </sup>,田志军<sup> 1*<br /><br /></sup><br /><br /><br /> 猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白毕赤酵母分泌表达及发酵条件优化<br /> /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170902 为实现猪圆环病毒2型(PCV2) Cap蛋白在酵母中的高效表达,本研究将去除信号肽并经序列优化后的PCV2 ORF2片段插入pPICZαA表达载体,将重组表达质粒克隆转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) X33感受态细胞中,应用Zeocin抗性和PCR法对转化子进行初步筛选和表型鉴定,利用“双膜法”筛选出PCV2 Cap表达量相对较高的酵母。采用正交试验对优选的酵母进行发酵试验,分析培养基pH、甲醇诱导时间、甲醇诱导浓度和诱导时酵母浓度对PCV2重组Cap蛋白(rCap)分泌表达的影响。结果显示酵母分泌表达PCV2 rCap的优化条件为:培养基pH为5.0,发酵液OD600nm至1.0,加入终浓度1.0 %甲醇诱导96 h。优化后的PCV2 rCap分泌量可达207.58 μg/mL。中和试验结果显示,发酵产物PCV2 rCap免疫小鼠产生的抗体可有效中和PCV2。本研究为利用酵母表达PCV2 Cap进行疫苗研制奠定了基础。<br /> 2017年09月12 00:00 2017年09 697 701 0 &nbsp;李中圣* ,伍建敏,王凤求,侯月娥,张杰,王贵平<br /> 猪氨基肽酶N不是猪德尔塔冠状病毒入侵宿主细胞的受体 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170903 &nbsp;猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新出现的冠状病毒,能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,临床症状与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)相似。相关研究表明猪氨基肽酶N (pAPN)是PED病毒(PEDV)和TGE病毒(TGEV)入侵宿主细胞的功能性受体。为研究pAPN是否是PDCoV入侵宿主细胞的受体,本研究以TGEV为指示病毒,通过BHK-pAPN细胞感染试验、pAPNRNA干扰试验、ST细胞过表达pAPN试验、可溶性pAPN阻断试验,发现BHK-pAPN细胞是PDCoV非易感细胞,在易感细胞ST上沉默和过表达pAPN对PDCoV的增殖并无影响,可溶性pAPN不能阻止PDCoV感染ST细胞。这些研究结果表明pAPN不是PDCoV入侵宿主细胞的受体,而且对PDCoV的增殖无影响。<br /> 2017年09月12 00:00 2017年09 702 707 0 &nbsp; <p>卢曼曼1,张家林1,王洪峰2,时洪艳1,张 鑫1,袁 婧1,石 达1,<br />刘建波1,陈建飞1*,冯 力1*<br /></p> 马传染性贫血病毒诱导马胎皮细胞发生自噬的研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170904 为研究马传染性贫血病毒(EIAV)感染对马胎皮细胞(FED)自噬的影响,本研究将EIAV感染FED以及过表达GFP-LC3的FED细胞,进行自噬现象的检测。结果显示,通过电镜观察到EIAV感染组细胞出现典型的双层膜结构的自噬小体,western blot检测到EIAV感染组细胞的LC3-II的表达量显著升高,通过激光共聚焦显微镜观察到EIAV感染的过表达GFP-LC3的FED细胞有明显的绿色荧光聚集。上述结果表明EIAV感染FED细胞后可以显著诱导FED细胞发生自噬。该研究结果为进一步研究自噬对EIAV复制和感染的调控奠定基础。<br />   2017年09月12 00:00 2017年09 708 711 0 &nbsp; <p>任会玲,王雪峰,杜 承,刘 聪,林跃智*,王晓钧*<br /></p> 一种lacZ报告基因T载体的构建及其在沙门氏菌鞭毛主<br />调控基因flhDC表达活性测定中的应用 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170905 为研究5’-非翻译区(UTR)对沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC表达的影响,本研究以鼠伤寒沙门氏菌542 (STM542)基因组DNA为模板,扩增含不同长度5’-UTR的flhDC全长基因(共5种),并将其克隆至含阿拉伯糖启动子的质粒PBAD33中。通过测定含阿拉伯糖的半固体平板上包含不同长度flhDC基因的重组大肠杆菌菌落的直径,初步评估不同5’-UTR调控序列对flhDC基因表达的影响。为精确测定不同调控序列的活性差异,本实验室进一步构建了以lacZ为报告基因的T载体,并将扩增的对应于前4种flhDC基因调控序列片段克隆于构建的T载体,通过测定其β-半乳糖苷酶活性获得相应调控序列的活性参数。结果显示,在阿拉伯糖诱导下,对应于1 572 bp的flhDC基因片段的调控序列活性最低,对应于1 201 bp的flhDC基因片段的调控序列活性最高,本实验为进一步研究flhDC基因的调控功能奠定基础。<br />   2017年09月12 00:00 2017年09 712 717 0 &nbsp; <p>刘 蕾,李永霞,刘金泽,王明晓,余旭平*<br /></p> 俄罗斯鲟源停乳链球菌停乳亚种分离、鉴定及药敏特性研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170906 2016年6月~8月,湖北鲟养殖场的俄罗斯鲟发生一种以上下嘴唇充血肿胀为特征的病害。为确定其发病原因,本研究对自然发病鱼的病灶及内脏器官进行了病原菌的分离,并对分离株进行人工感染、毒力检测、生理生化特性测定及16S rRNA基因序列分析。结果从患病俄罗斯鲟体内分离到一株优势菌,人工感染试验出现与自然发病类似症状,确定其为俄罗斯鲟本次发病的病原菌,其对俄罗斯鲟幼鱼的半数致死剂量为3.64×104&nbsp; cfu/g,该分离株生理生化特性与停乳链球菌停乳亚种一致;经16S rRNA基因序列比对及构建系统发育树结果显示,该分离株与停乳链球菌停乳亚种聚为一支,同源性在99 %以上。该分离株鉴定为停乳链球菌停乳亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae),命名为HD03。药敏试验结果表明,HD03株对环丙沙星、痢特灵及氟苯尼考等8种抗生素敏感,对苯唑西林、头孢唑林及阿莫西林等7种抗生素耐药。本研究首次证实停乳链球菌停乳亚种是俄罗斯鲟的病原菌,养殖时可以选用氟苯尼考进行防控。<br />  2017年09月12 00:00 2017年09 718 722 0 &nbsp; <p>杨移斌<sup>1,2</sup>,杨秋红<sup>1,2</sup>,刘永涛<sup>1,2</sup>,胥 宁<sup>1,2</sup>,杨先乐<sup>3</sup>,艾晓辉<sup>1,2*<br /></sup></p> 检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条的研制 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170907 为建立水禽源细小病毒的快速检测方法,本研究采用纯化的小鹅瘟病毒(GPV)免疫BALB/c 小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,筛选到21株能够稳定分泌抗GPV的单克隆抗体(MAb),将1株MAb纯化后与胶体金结合,喷涂金标垫,与另一株纯化的MAb配对,制成检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条。特异性试验表明,鹅细小病毒、番鸭细小病毒和新型番鸭细小病毒的检测结果均为阳性,猪细小病毒、1型鸭甲肝病毒、坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9N2亚型禽流感病毒、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒等的检测结果均为阴性。该方法对鹅细小病毒、番鸭细小病毒和新型番鸭细小病毒的最低检出量分别为104.7,ELD50/mL、104.7 ELD50/mL和105.7 ELD50/mL。重复性试验良好。对临床粪便样品的检测,该方法比PCR方法简单快速,但是存在漏检的情况。上述结果表明,本实验建立的方法可用于水禽源细小病毒病的初步快速筛查。<br />  2017年09月12 00:00 2017年09 723 727 0 &nbsp; <p>程龙飞<sup>1</sup>,张长弓<sup>2</sup>,傅秋玲<sup>1</sup>,何 琼<sup>2</sup>,贾志娟<sup>2</sup>,陈慧敏<sup>2</sup>,傅光华<sup>1</sup>,万春和<sup>1</sup>,<br />林群群<sup>1</sup>,刘荣昌<sup>1</sup>,黄 瑜<sup>1*<br /></sup></p> 猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及应用 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170908 为建立一种用于检测猪圆环病毒3型(PCV3)的PCR方法,本研究针对GenBank中PCV3全基因序列在其保守区设计一对特异性引物,并优化反应条件,建立了PCV3的PCR检测方法。结果显示,该PCR方法仅对PCV3检测为阳性,而对其它常见病原的DNA模板均无扩增。对PCV 3的最低检出量为61.9拷贝/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性。通过该方法对133份临床样品进行检测,结果显示PCV3阳性率为29 % (38/133),表明PCV3在河南地区已有流行。该方法的建立使PCV3的检测更为快速、简便、经济、实用,为PCV3感染的早期诊断提供了有力的技术支持。<br />   2017年09月12 00:00 2017年09 728 731 0 &nbsp; <p>徐朋丽<sup>1</sup>,张鸿鑫<sup>1</sup>,张 宇<sup>1</sup>,韩昊莹<sup>1</sup>,刘 芳<sup>1,2</sup>,史冠男<sup>1</sup>,赵 宇<sup>1</sup>,郑兰兰<sup>1</sup>,陈红英<sup>1,2*<br /></sup></p> 无乳链球菌恒温热隔绝式PCR快速检测方法的建立 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170909 为建立快速检测无乳链球菌的方法,本研究针对无乳链球菌表面免疫原性蛋白sip基因的保守区域设计特异性引物,建立了快速检测无乳链球菌的恒温热隔绝式PCR (iiPCR)方法。该检测方法能在30 min内迅速扩增出大量大小为105 bp的目的条带;并与肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌均无交叉反应;检测下限为102 拷贝/μL,优于普通PCR方法。本研究建立的检测方法具有操作简便、高特异性、高敏感性及高扩增效率的特点,适用临床或基层实验室使用。<br />   2017年09月12 00:00 2017年09 732 735 0 &nbsp; <p>王 娟<sup>1*</sup>, 卞国志<sup>1,2*</sup>,贾 坤<sup>2</sup>,刁巧虹<sup>2</sup>,李守军<sup>2</sup>,王贵平<sup>1</sup>,袁建丰<sup>1*<br /></sup></p> 茁-内酰胺酶抑制剂快速筛选方法的建立<br /> /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170910 为建立用于抗耐药菌的 茁-内酰胺酶 ( 茁- lactamase) 抑制剂快速筛选方法,本研究采用双层平板法,以 2 % 的琼脂为底层, 1 % 的含碘试剂为上层,以青霉素为 茁-内酰胺酶的底物,克拉维酸作为体系验证的阳性对照,通过比较透明圈形成大小,优化反应体系,并对 190 个微生物发酵产物进行了初步筛选。研究最终确定的筛选条件为, pH7.0 的 PBS 缓冲液体系,底物青霉素 (160 万单位 ) 浓度为 50 mg/mL ,茁-内酰胺酶浓度为 10 U /mL ,40 ℃ 孵育 40 min 。通过测量反应体系透明圈形成大小来筛选具有活性的 茁-内酰胺酶抑制剂。结果证实该方法可以为耐药菌 茁-内酰胺酶抑制剂的筛选提供快速简单、易行、稳定、可靠的研究平台,并初步筛选获得了具有较高 茁-内酰胺酶抑制活性的化合物。<br /> 2017年09月12 00:00 2017年09 734 739 0 张新国<sup>1*</sup>,王文娜<sup>1</sup> ,王学智<sup> 2*</sup> ,魏国兴 <sup>1</sup> ,李剑勇<sup> 2 </sup>,陈晓前<sup> 1<br /></sup><br /><br /> 泰山松花粉多糖对 PRRSV GP5 亚单位疫苗免疫增强作用的研究<br /> /oa/darticle.aspx?type=view&id=20170911 为研究泰山松花粉对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5的免疫增强作用,本研究以原核表达的高致病性PRRSV GP5蛋白为抗原,添加不同剂量的天然提取的泰山松花粉多糖(TPPPS)作为免疫佐剂配制PRRSV亚单位疫苗。选取72只SPF昆明小鼠随机分为6组(I-VI),12只/组。I组免疫纯化的GP5亚单位疫苗,II-IV组分别免疫不同浓度的TPPPS (20 mg/mL、40 mg/mL、60 mg/mL)佐剂GP5亚单位疫苗,V组免疫弗氏不完全佐剂GP5亚单位疫苗,VI组注射PBS;1周后各组均加强免疫1次,加强免疫后,每周每组随机挑选3只小鼠采集外周血,分别检测小鼠血清抗体效价、T淋巴细胞亚群比例、T淋巴细胞转化率和细胞因子的含量,评价TPPPS对PRRSV-GP5蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。结果显示,所有疫苗免疫组小鼠的上述免疫指标比对照组均有显著提高,而添加TPPPS和弗氏佐剂的疫苗组各项指标均显著高于单独GP5蛋白免疫组。3个浓度的TPPPS佐剂中,60 mg/mL浓度的免疫增强效果最显著。本研究表明,重组表达的PRRSV GP5蛋白能够诱导动物机体显著的免疫应答,TPPPS佐剂对PRRSV GP5蛋白呈现显著的免疫增强效果。本研究为研制PRRSV亚单位疫苗提供了参考。<br />   2017年09月12 00:00 2017年09 742 745 0 &nbsp;袁艳梅<sup>1*</sup> ,彭军<sup>1*</sup> ,胡莉萍 <sup>2</sup> ,朱丽君 <sup>1</sup> ,王淑娟<sup> 1</sup> ,董雯雯 <sup>1</sup> ,马宁宁 <sup>1</sup> ,周建波 <sup>1 </sup>,<br />卢亚平 <sup>1</sup> ,李宗瑞<sup>1 </sup>,魏凯<sup>1</sup> ,王海荣<sup> 1*</sup> ,朱瑞良 1*<br />