中国预防兽医学报 /oa 三株鸭源H7N2亚型禽流感病毒的遗传进化分析及其致病性研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191201 为了解我国H7N2亚型禽流感病毒(AIV)的进化及评估病毒对动物的致病性风险,本研究对2012年~2015年从浙江和湖南省活禽市场分离到的3株鸭源H7N2亚型AIV进行了遗传演化分析,并研究了其对家禽和哺乳动物小鼠的致病性。基因序列分析显示,3株病毒均是多个亚型AIV的重组体,表明不同来源病毒具有明显的基因多样性,可分为3个基因型。鸡的感染性试验结果显示,滴鼻感染3 d后,3株病毒感染组鸡的喉头、泄殖腔均有部分排毒,其中仅DK/ZJ/S3192/2012分离株可在鸡的脏器中检测到病毒,提示鸭源性H7N2亚型AIV在鸡体内仅具有有限的复制能力;鸭的感染性试验结果显示,3株病毒在鸭的脏器内均有不同程度的复制;小鼠的感染性试验结果表明,3株病毒均可以在没有预先适应的小鼠肺和鼻甲中高效复制,其中DK/HuN/ S1515/2014分离株可在被迫杀的3只小鼠中的1只小鼠的脑组织中复制。以上结果表明3株H7N2亚型 AIV对家禽和小鼠均呈现低致病力。本研究为H7N2 AIV的持续监测提供了数据支持,并且评估了其可能导致人类感染的风险。<br /> 2020年01月25 00:00 2019年12 1193 1198 0 &nbsp; <p>李 梅,尹 馨,侯玉杰,邓国华,崔鹏飞,房敬真,施建忠*,陈化兰*<br /></p> 伪狂犬病病毒变异株和经典株对小鼠致病力差异的研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191202 为评价伪狂犬病病毒(PRV)变异株和经典株对小鼠的致病力差异,本研究将PRV变异株(PRVTJ)和经典株(PRVSC)以103 TCID50的剂量经肌肉注射途径接种小鼠之后,通过观察小鼠的临床症状、记录小鼠的体质量变化和死亡率,利用荧光定量PCR (qPCR)检测小鼠各组织中病毒基因拷贝数,分析小鼠各组织脏器的病理学变化,系统评价PRV变异株和经典株的致病力差异。研究结果显示,接种PRVTJ和PRVSC的小鼠在临床表现上无明显差异,但接种PRVTJ的小鼠体质量下降明显,死亡率相对更高;qPCR检测结果显示,PRVTJ对小鼠的组织嗜性增强,尤其是对脑组织的嗜性增强;病理组织学分析结果显示,接种PRVTJ的小鼠脑组织的炎性病变更明显。本研究初步证实,PRVTJ对小鼠的致病力增强,且其毒力增强的主要原因是对小鼠的神经嗜性增强。本研究为PRV变异株致病力增强机制研究奠定了基础。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1199 1203 0 &nbsp; <p>王亚林<sup>1</sup>,金 钊<sup>2</sup>,祁寒松<sup>1</sup>,仇华吉<sup>1*</sup>,孙 元<sup>1*<br /></sup></p> 猪源A型产气荚膜梭菌β2毒素与宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191203 产气荚膜梭菌产生的β2毒素在仔猪肠炎中起着重要作用,为研究该毒素侵入宿主细胞的作用机制,本研究以β2为诱饵蛋白,将其与酿酒酵母转录因子 GAL4 的BD (DNA binding domain)融合表达,利用猪肠上皮细胞系IPEC-1的cDNA文库与GAL4 的AD 区(Activation domain)融合表达,通过酵母双杂交系统筛选鉴定与β2毒素相互作用的猪肠上皮细胞蛋白。筛选得到的阳性转化子经提取质粒和测序后,比对其所包含的编码蛋白序列,得到4个潜在的与β2毒素存在相互作用的细胞蛋白,分别为S20、LGALS1、L12和Atrophin-1。其中S20、L12和Atrophin-1是位于细胞内的核蛋白,而LGALS1是一种存在于细胞膜外侧的半乳糖凝集素,可能是毒素的作用位点。对LGALS1进行回交验证,结果显示其C端与β2毒素的相互作用强于其完整蛋白与β2毒素的相互作用。本研究结果对研究β2毒素的致病机制奠定了基础。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1204 1209 0 &nbsp; <p>曾 秀<sup>1</sup>,张兰桥<sup>2</sup>,周 姣<sup>1</sup>,王婧祺<sup>1</sup>,戴益民<sup>1</sup>,张锦华<sup>1*<br /></sup></p> 2017年我国4个省份屠宰场猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191204 为研究我国不同地区屠宰场猪链球菌的流行情况,本研究于2017年分别从河南、黑龙江、广东、宁夏4个地区大型屠宰场采集健康猪肺脏样品578份,进行猪链球菌的分离鉴定、血清型分型;通过微量肉汤稀释法测定分离株的最小抑菌浓度(MIC);PCR方法检测分离菌的耐药基因和毒力基因;通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分析不同来源分离株间的亲缘关系。结果显示,从4省市共分离到猪链球菌46株,包括12种血清型和3种荚膜新型血清型,其中猪链球菌血清7型分离率最高,为30.4 %,但不同地区血清型交叉密度较低。分离菌株表现出广泛耐药性,其中对红霉素、阿奇霉素、多西环素的耐药率较高,分别为91.30 %、86.96 %、86.96 %,但分离株均对万古霉素敏感。红霉素类耐药基因erm和四环素类耐药基因tet的检出率均较高,其中erm(B)为97.83 %,tet(O)为89.13 %。PFGE结果显示不同地区分离菌株PFGE谱型差异明显,而同一地区分离菌株PFGE谱型相似或相同,提示同一地区猪链球菌存在克隆传播现象。本研究揭示了我国不同地区猪链球菌流行情况,为猪链球菌病的防控提供参考依据。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1210 1214 0 &nbsp; <p>王长珍<sup>1</sup>,刘文宇<sup>1</sup>,祝 瑶<sup>1</sup>,栾 天<sup>1</sup>,于 淼<sup>2</sup>,杨 亲<sup>1</sup>,刘思国<sup>1</sup>,张万江<sup>1*<br /></sup></p> 鲫鱼类志贺邻单胞菌的鉴定及其致病机制研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191205 为了鉴定从患病鲫鱼体内分离的F01菌株并探究其致病性,本研究经形态学观察、16S rDNA基因分析鉴定F01菌株,并进行药敏试验,采用动物回归试验及病理组织学观察研究其对鲫鱼的致病性,同时检测感染鲫鱼的血清学指标及免疫因子表达。结果显示:F01菌株经16S rDNA基因序列比对与类志贺邻单胞菌的同源性达99 %,确定该菌株为类志贺邻单胞菌,其对鲫鱼的半数致死量LD50为2.09×107 cfu/mL,且动物回归实验结果显示从人工感染鲫鱼分离出的细菌与患病鲫鱼一致。耐药性检测结果显示,该菌株对头孢曲松、头孢呋辛、氧氟沙星等敏感,对哌拉西林、克林霉素、多西环素等耐药。病理组织学观察显示,感染鲫鱼的肝、肾等组织充血、肿胀、变性坏死。血清学检测结果显示,与对照组比较,感染组鲫鱼血清AKP、LZM均活性上升、MDA活力均下降(p&lt;0.05);免疫因子检测结果显示,感染10 d后鲫鱼脾脏中HSP70、IL-8、TLR22基因的转录水平显著高于正常对照组(p&lt;0.05)。本研究通过对F01菌株的致病性等研究,为深入研究类志贺邻单胞菌的疫病防治提供科学参考。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1215 1220 0 &nbsp; <p>傅 芳<sup>1</sup>,谈永萍<sup>2</sup>,王 利<sup>1,2*</sup>,张 桦<sup>2<br /></sup></p> 北美型猪繁殖与呼吸综合征竞争<br />ELISA抗体检测方法的建立及初步应用 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191206 为建立快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的ELISA方法,本研究以纯化的PRRSV全病毒为包被抗原,利用抗北美型PRRSV M蛋白的特异性单克隆抗体为竞争抗体,经条件优化,建立了特异性检测北美型PRRSV的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示,最佳抗原包被量为660 ng/孔,待检血清样本稀释度为1∶2,竞争抗体最佳稀释度为1∶8。ELISA结果判定标准:血清样本抑制率PI≥25.65 %时判定为阳性,PI&lt;25.65 %判定为阴性。特异性试验结果显示,该方法仅能检测北美型PRRSV,与PRV、PCV2、CSFV、PEDV、TGEV等猪病毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法能检测出128倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10 %。利用该方法对黑龙江地区收集的546份临床血清样品进行检测,PRRSV抗体阳性率达95.1 %,与商品化IDEXX PRRSV试剂盒的符合率为95.8 %。本研究建立的C-ELISA方法为PRRS的流行病学调查、临床上疫苗评估及免疫前后抗体水平监测提供了有效的检测手段。<br /> 2020年01月25 00:00 2019年12 1221 1226 0 &nbsp; <p>李宛生<sup>1?</sup>,李敏华<sup>3?</sup>,杨建伟<sup>1</sup>,田志军<sup>2</sup>,王 倩<sup>2*</sup>,冷超粮<sup>1*<br /></sup></p> 猪源沙门氏菌聚合酶螺旋反应方法的建立与应用 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191207 为建立一种快速、高效地检测猪源沙门氏菌的聚合酶螺旋反应(PSR)方法,本研究针对猪源沙门氏菌侵袭蛋白A (invA)基因设计3套特异性扩增引物,通过优化孵育温度、dNTPs和Mg2+浓度、Bst聚合酶浓度和反应时间初步建立了猪源沙门氏菌PSR方法。结果显示:该方法可以特异性扩增2株猪沙门氏菌,而对其它12株病原菌无扩增,特异性较强;以沙门氏菌标准株CMCC 50094为模板,并经一系列的稀释,对PSR、LAMP和qRCR方法的敏感性进行检测和比较,结果显示PSR方法和qPCR方法对菌液的最小检出量均为5×101 cfu/mL,敏感性为LAMP方法的10倍,敏感性较高;临床样品检测结果显示,经PSR方法在132份仔猪腹泻样本中共检测出猪源沙门氏菌阳性样品18份,与常规培养方法鉴定结果一致,检出率均为13.64 %。本研究建立的PSR法为猪源沙门氏菌的快速检测提供了一种可行方法。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1227 1232 0 &nbsp; <p>胡瑞鸿,从秋实,李艳飞*<br /></p> 布鲁氏菌RPA-LFD检测方法的建立 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191208 为建立一种快速,便于现场检测布鲁氏菌的方法,本研究基于布鲁氏菌(Brucella) Omp31基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件优化建立了布鲁氏菌重组酶聚合酶-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,对该方法进行特异性、敏感性、重复性检测。结果显示该检测方法在39 ℃反应20 min以上便可肉眼观察到明显结果。特异性试验结果显示除布鲁氏菌基因组呈阳性外,维氏气单胞菌、大肠杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、乙型溶血性链球菌均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到101拷贝/μL的质粒标准品,比常规PCR高出100倍,敏感性较高;重复性试验结果显示,3次批间重复试验无明显差异,稳定性良好。利用该方法检测34份临床样品,其检测结果与普通PCR检测结果符合率为100 %。本研究建立了一种快速检测布鲁氏菌的方法,该方法不需要特殊的仪器,操作简便,灵敏度高,肉眼即可观察到结果,为布鲁氏菌病的现场快速诊断提供了帮助。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1233 1237 0 &nbsp; <p>于 博<sup>1</sup>,李博宇<sup>1</sup>,赵 博<sup>1</sup>,李 东<sup>1</sup>,李健明<sup>2</sup>,时 坤<sup>2</sup>,曾范利<sup>2</sup>,宗 颖<sup>2</sup>,杜 锐<sup>2*<br /></sup></p> 延边白鹅CD4与CD8基因SYBR Green I 荧光定量PCR方法的建立与应用 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191209 为建立延边白鹅CD4与CD8基因在细胞免疫中的动态变化的检测方法,本研究根据CD4与CD8基因保守区分别设计两对特异性引物,在克隆目的基因的基础上,进行TA克隆和转化,构建的阳性质粒作为标准品,经反应条件优化建立了检测延边白鹅CD4与CD8基因的荧光定量PCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法在质粒标准品稀释倍数为101~108倍(CD4:1.2×108拷贝/μL~1.2×101拷贝/μL;CD8:1.8×108拷贝/μL~1.8×101拷贝/μL)范围内具有良好的线性关系,相关系数均为0.999,与其它相关鹅细胞因子基因不发生交叉反应,敏感性均是普通PCR的100倍,组内和组间变异系数均小于2 %。初步应用本研究建立的方法检测鹅脾脏淋巴细胞CD4与CD8基因的转录水平,结果显示ConA可诱导目的基因转录水平升高,且显著高于PBS对照组(p&lt;0.05)。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法为进一步研究鹅细胞免疫水平和CD4、CD8生物学活性奠定了基础。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1238 1243 0 &nbsp; <p>王美淇<sup>†</sup>,李远超<sup>†</sup>,李文佳,陈 姗,孟 媛,刘晋宇,高 旭<sup>*</sup></p> TLR4-/- DF1细胞系感染NDV后免疫机制的初步研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191210 为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4-/- DF1细胞系;利用新城疫病毒(NDV)感染TLR4-/- DF1细胞系,采用绝对荧光定量PCR检测NDV拷贝数,相对荧光定量PCR检测TLR4下游接头蛋白、细胞因子及干扰素基因的转录水平。结果显示:与野生型DF1细胞相比,NDV感染6 h、16 h和36 h的TLR4-/- DF1细胞中病毒基因拷贝数显著升高(p&lt;0.05),16 h升高了2.95倍,感染6 h、16 h和24 h下游接头蛋白MyD88基因转录水平下降,感染16 h促炎因子IL-1β下降了48.5 % (p&lt;0.01),IL-8下降了62.5 % (p&lt;0.01),I型干扰素转录水平下降。以上结果表明:NDV感染诱导的天然免疫应答可能是通过MyD88途径诱导高水平促炎性因子和I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,从而抑制NDV的增殖,TLR4在NDV感染引起的天然免疫应答和疾病防控研究中具有重要意义。同时,本研究TLR4-/- DF1细胞系的建立可用于病毒引起的炎性因子风暴及天然免疫抗病毒作用的探究。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1244 1250 0 &nbsp; <p>王 辉<sup>1,2</sup>,鲁国涛<sup>2</sup>,许 曼<sup>1,2</sup>,曾为俊<sup>1,2</sup>,邵玉乐<sup>1,2</sup>,赵丽丽<sup>2</sup>,陈洪岩<sup>2</sup>,刘建华<sup>1*</sup>,孟庆文<sup>2*<br /></sup></p> 血清4型禽腺病毒fiber-2基因在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191212 为研究I群血清4型禽腺病毒(FAdV-4) fiber-2蛋白的免疫原性,本研究利用杆状病毒表达系统构建了含fiber-2基因的重组杆状病毒穿梭载体,将其转染Sf9细胞后获得重组杆状病毒rBA-fiber-2,并采用悬浮放大工艺表达重组fiber-2蛋白。通过间接免疫荧光试验(IFA)和western blot鉴定重组蛋白fiber-2的表达,并采用免疫琼扩试验(AGP)检测fiber-2蛋白效价。以fiber-2蛋白作为免疫原制备油乳剂疫苗免疫SPF鸡进行免疫效力试验,分别设fiber-2疫苗组、fiber-2疫苗配伍免疫增强剂CVCVA5组及生理盐水对照组。免疫后14 d、21 d和28 d采集SPF鸡外周血分离血清,利用AGP法检测其血清抗体水平。IFA结果显示 fiber-2蛋白在昆虫细胞中获得表达;western blot结果显示该蛋白能够与FAdV-4阳性血清发生特异性免疫反应,蛋白分子量约62 ku;AGP结果显示fiber-2蛋白AGP效价达1∶16。免疫后14 d两组实验组鸡均可检测到特异性琼扩抗体,免疫后28 d fiber-2疫苗组SPF鸡抗体AGP效价平均值可达1∶24,配伍CVCVA5疫苗组SPF鸡抗体AGP效价平均值可达1∶104。以上结果表明fiber-2蛋白具有一定的免疫原性,免疫后可诱导机体产生特异性抗体,本研究为进一步研制FAdV-4亚单位疫苗提供实验依据。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1251 1255 0 &nbsp; <p>梅 梅<sup>1,2,3,4</sup>,陆吉虎<sup>1,2,3,4</sup>,张雪花<sup>1,2,3,4</sup>,唐应华<sup>1,2,3</sup>,卢 宇<sup>1,2,3</sup>,侯继波<sup>1,2,3*<br /></sup></p> 猪圆环病毒2型的分离鉴定及高免卵黄抗体的研制 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191213 为制备猪圆环病毒2型(PCV2)特异性高免卵黄抗体(IgY),本研究首先对2017年~2018年河南部分地区规模化养猪场采集的19份疑似感染PCV2猪的病料样品进行PCR检测,对阳性样品进行PCV2全基因组测序分析、病毒分离鉴定、制备灭活疫苗免疫蛋鸡并制备其IgY,对制备的IgY经中和试验检测其中和活性。比较氯仿法与水稀释-硫酸铵沉淀法制备的IgY的纯度差异。结果显示,河南省部分地区的PCV2阳性率为63.2 %(12/19)。PCV2全基因组序列分析显示,12株PCV2之间的同源性为96.9 %~100 %,与其它PCV2代表株之间的同源性为95.1 %~99.9 %。遗传进化分析显示,8株PCV2属于PCV2d亚型,4株属于PCV2b亚型。病毒分离结果显示,7份阳性样品可以分离出病毒,其中一株病毒效价达106.5 TCID50/mL。用该株病毒制备的PCV2灭活疫苗免疫蛋鸡能够诱导其产生较高水平的特异性IgY。中和试验结果显示,该IgY对PCV2具有较高的中和活性,中和效价达1∶181。此外,通过比较氯仿法和水稀释-硫酸铵沉淀法制备IgY的效果显示,两种方法均较为理想,但前者获得的样品纯度更高。本研究为进一步开展IgY抗PCV2研究奠定了基础。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1256 1261 0 &nbsp; <p>丁雨善,翟洪月,李明亮,鲍 印,杨德全,李 娜,姚伦广,阚云超*,冷超粮*<br /></p> 三基因缺失重组弱毒株(PRV-HNX-TK-/gE-/gG-+<br />PCV2 ORF2)不同途径免疫的效果分析 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191214 为评价口服免疫猪伪狂犬病毒三基因缺失重组弱毒株 PRV-HNX-TK-/gE-/gG-+PCV2 ORF2对母源抗体阳性保育猪的保护效果,本研究将该重组弱毒株通过口服和颈部肌肉注射两种不同途径免疫母源抗体阳性的断奶仔猪,通过ELISA方法测定血清PRV gB抗体、PCV2 Cap抗体和IFN-γ水平,利用固定病毒-稀释血清的中和试验方法检测PRV中和抗体水平;免疫结束后攻毒,记录各组猪临床表现和病理变化、测定其鼻拭子和肛拭子中病毒排毒时间、病毒载量等指标。结果显示,整个免疫试验过程中,口服组与注射组猪的PRV gB抗体均维持阳性、血清中PRV中和抗体效价均高于1∶4、IFN-γ含量在免疫后均能达到300 pg/mL以上,PCV2抗体阳性率则出现下降;而未免疫组猪在第7 d后gB抗体转阴,中和抗体效价低于1:4、IFN-γ含量维持在约250 pg/mL,PCV2抗体阳性率(母源抗体)持续到二免后28 d才开始下降。免疫后攻毒,检测结果显示,口服组与注射组比对照组猪提前2 d体温下降,提前7 d恢复采食,而对照组猪出现高温、打喷嚏、咳嗽、流鼻涕、食欲不振、精神沉郁和神经症状并持续至攻毒后第8 d,并于攻毒后第12 d开始采食;口服组与注射组猪排毒高峰在攻毒后第2 d~6 d,第12 d后均停止排毒,对照组猪排毒持续期大于14 d;脑组织病理切片观察可见,口服组与注射组猪脑组织中仅少量小胶质细胞和淋巴细胞增多,而对照组猪脑组织中出现胶质细胞结节、血管袖套现象、卫星现象、噬神经元现象等病理变化,对照组猪扁桃体隐窝腔内含有大量脱落的隐窝上皮细胞、白细胞和炎性渗出液,并有燕麦细胞增多。以上结果表明口服方式免疫该三基因缺失重组弱毒株能够使保育猪产生针对PRV的有效免疫应答,但并不能诱导高水平的PCV2抗体。本研究为PRV疫苗研发带来了新的方向,也为免疫途径提供了更多选择,同时首次证实了该缺失弱毒株口服和肌注均能提供相似的免疫保护效果。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1261 1267 0 &nbsp; <p>吴 昊<sup>1,2,3</sup>,牛伟杰<sup>2,3</sup>,王久红<sup>2,3</sup>,胡耀方<sup>2,3</sup>,姚 伦<sup>2,3</sup>,库旭钢<sup>3</sup>,何启盖<sup>1,2,3*<br /></sup></p> 三种噬菌体裂解基因对大肠杆菌致死效果的比较 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191215 为比较3种噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E对大肠杆菌的致死效果,本研究将噬菌体裂解基因M-lysis、mE和E克隆于严谨调控的高效表达载体pN15E6中,构建重组质粒pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE和pN15E6-E,分别转化入JM109和DH31soplacI二种大肠杆菌中,观察重组大肠杆菌在含IPTG诱导剂平板培养基上的生长情况,判定M-lysis、mE、E基因过表达对大肠杆菌宿主的影响。结果显示,在大肠杆菌JM109菌株中,mE基因过表达仅表现出抑制细菌生长的效果;M-lysis基因过表达部分致死细菌,存活菌生长受到抑制;E基因过表达能够致死绝大部分细菌,但有少量耐受菌生长。在大肠杆菌DH31soplacI菌株中,M-lysis与mE基因过表达也能致死绝大部分细菌,有少量耐受菌生长;而E基因过表达则完全致死涂布于平板上经106稀释的菌株,未见任何菌落生长。将重组菌株稀释后经平板菌落计数,测得M-lysis、mE、E基因过表达后对DH31soplacI菌株致死率分别为99.03 %、99.68 %和99.9998 %,表明E基因过表达后对宿主菌的致死作用最强;同时定期测定培养的3种重组菌OD600nm值,并绘制生长曲线,结果显示过表达E基因能够迅速致死和裂解细菌。本研究为进一步开发噬菌体裂解肽奠定基础,也为探究细菌致死机理提供了一种新模型。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1268 1274 0 &nbsp; <p>张远星,李统战,余子豪,查 帆,李倩文,余旭平*<br /></p> 西南地区PRRSV分子流行病学调查及其类NADC30株基因组特征分析 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191216 为了解我国西南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的遗传变异和分子流行病学情况。本研究采集2018年我国四川、重庆、贵州和云南4省共计41个猪场292份疑似PRRS患病保育猪病料样本(肺脏样本48份和血清样本244份),对其进行PRRSV ORF7基因的检测和流行株全基因组特征分析。结果显示PRRSV的检出率为44.18 % (95 % confidence interval (CI)=38.4 %~50.1 %,129/292)。通过RT-PCR检测129份阳性样本的NSP2基因,结果有64份样品检出该基因。经测序分析表明类NADC30病毒株、高致病性病毒株(HP-PRRSV)和经典株的检出率分别为70.3 % (95 % CI=57.6 %~81.1 %,45/64)、12.5 % (95 % CI=5.6 %~23.2 %,8/64)和17.2 % (95 % CI=8.9 %~28.7 %,11/64)。通过对7株病毒基因组同源性分析结果表明其均与类NADC30病毒株SD53-1603同源性最高,为95.6 %~96.4 %,与欧洲型病毒株LV同源性最低,为58.7 %~59.5 %;通过对7株PRRSV基因组进行遗传演化分析结果显示其均与类NADC30病毒株聚为一大支;重组分析结果显示其均未与任何病毒株发生基因重组。序列分析显示7株病毒株均在GP5蛋白发生了一个氨基酸(S/N33)的缺失,并且存在该缺失模式的病毒已经在我国其它地区存在和流行。本研究表明近年来我国西南地区类NADC30病毒株的感染率呈逐年上升趋势,并且已经成为西南地区PRRSV的优势流行株。提示规模化养殖场应更加注重生物安全,完善引种程序,避免引入新的类NADC30病毒株。<br />   2020年01月25 00:00 2019年12 1275 1279 0 &nbsp; <p>周 群<sup>1</sup>,周可磊<sup>1</sup>,胡承哲<sup>1</sup>,李 玉<sup>1</sup>,任玉鹏<sup>1,2</sup>,岳 华<sup>1,2</sup>,张 斌<sup>1,2*<br /></sup></p> 小鼠脑干3β羟基类固醇脱氢酶1免疫阳性神经元信号检测方法的优化 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191217 &nbsp; 2020年01月25 00:00 2019年12 1280 1284 0 &nbsp; <p>曹晓娟<sup>1</sup>,李 强<sup>2</sup>,范奎奎<sup>3</sup>,潘 登<sup>3</sup>,刘昊东<sup>3</sup>,王 昆<sup>2</sup>,海日汗<sup>1</sup>,杜晨光<sup>1,3*<br /></sup></p> STING的免疫调控作用研究进展 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191218 2020年01月25 00:00 2019年12 1285 1288 0 &nbsp; <p>马瑞仙<sup>1,2</sup>,李向茸<sup>1</sup>,冯若飞<sup>1*<br /></sup></p> Toll 样受体7 介导抗流感病毒免疫反应研究进展 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20191219 2020年01月25 00:00 2019年12 1289 1293 0 &nbsp; <p>史玉聪<sup>†</sup>,许华冲<sup>†</sup>,陈孝银<sup>*<br /></sup>  </p> 整合素β1是狂犬病病毒外周感染的重要宿主因子 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20191201 狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的重要人兽共患病,全球每年因狂犬病致死人数高达6万人,我国仍然是受狂犬病危害最严重的国家之一,仅次于印度。自然条件下,人和动物被患病动物从外周抓咬感染RABV,最终侵染神经系统,一旦出现神经症状,致死率几乎100 %。然而,由于针对RABV感染宿主细胞的作用机制研究不够充分,目前仍然没有针对狂犬病的特效治疗药物。因此,寻找决定RABV侵入过程的关键宿主蛋白,对深入阐明RABV致病机制、筛选有效的药物靶点或设计新型疫苗具有重要意义。<br />  近日,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病研究团队在RABV侵入宿主细胞的机制研究方面取得重要进展,发现整合素β1 (Integrin β1,ITGB1)为影响RABV外周感染的重要宿主因子,相关研究在《Journal of Virology》上在线发表(<a href="https://jvi.asm.org/content/early/2019/10/24/">https://jvi.asm.org/content/early/2019/10/24/</a> JVI.01819-19.long)。本研究首次证明了整合素蛋白家族成员与RABV存在直接相互作用关系。<br />  ITGB1是整合素家族成员,可以通过介导细胞与细胞外基质之间的信号转导影响多种病原的早期感染。ITGB1为I型膜蛋白,广泛分布于不同组织细胞,是脊椎动物外周和中枢神经系统发育的重要蛋白,但其在成年动物的肌肉和中枢神经系统存在差异性表达。RABV的囊膜糖蛋白(G)是介导RABV侵入宿主细胞的主要功能蛋白。该团队研究发现,ITGB1与G存在直接相互作用,并与RABV粒子一起内吞,在细胞内运输系统中被一起运输至早期和晚期内吞体;ITGB1可溶性蛋白、ITGB1单克隆抗体(MAb)和RGD肽能够体外中和或阻断RABV的感染,并具有剂量依赖性。小鼠体内研究表明,ITGB1在肌肉组织中大量表达,并与RABV抗原在RABV街毒接种的肌肉组织中共定位;ITGB1可溶性蛋白能够中和RABV街毒致死剂量的感染;ITGB1 MAb和RGD肽均能够阻断RABV街毒外周感染的致死攻击,但不能阻断RABV街毒中枢感染的致死攻击。以上研究结果表明ITGB1是RABV外周感染的关键宿主因子。<br />  本研究对RABV外周侵入机制的研究丰富了RABV侵入宿主机制的理论体系,为RABV抗病毒药物的研究提供了参考,同时为深入研究RABV的致病机制奠定了基础。<br /> 2020年01月25 00:00 2019年12 1294 1294 0 II型PRRSV编码的Nsp12参与病毒亚基因组RNA的合成 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20191202 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以母猪严重的繁殖障碍和断奶仔猪呼吸道症状为主的疾病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类传染病。1995年,我国郭宝清等人从流产母猪胎儿中首次分离得到PRRSV;2006年,我国南方多省先后暴发以持续性高热、精神沉郁、呼吸困难、气喘和部分猪伴有皮肤发红变紫等症状的高致病性的PRRS (Highly pathogenic PRRS, HP-PRRS)。PRRSV分为2个基因型,分别为I型(欧洲型)和II型(北美洲型)。在中国的流行株主要为II型。2008年,农业部将HP-PRRS列为一类动物疫病。目前,PRRSV在我国流行状况复杂,经典株与变异株并存,近年来NADC30病毒株在我国出现并流行,且出现重组PRRSV病毒株,这给中国PRRS的防控带来严峻挑战。对PRRSV生命周期过程的基础研究将对PRRS的防控具有重要的指导意义。<br />  PRRSV为单股正链RNA病毒,其基因组包含ORF1a、ORF1b和ORF2~ORF7。ORF1a和ORF1b主要编码PRRSV复制酶,其被认为是病毒的非结构蛋白(Nonstructural proteins,Nsp)编码区。根据生物信息学预测与实验证实,ORF1a区与ORF1b区共编码12个Nsps。其中Nsp1与PRRSV亚基因组mRNAs的合成相关;Nsp2与Nsp3参与复制相关复合体双层膜泡(Double membrane vesicles,DMVs)的形成,目前研究认为PRRSV的复制是在DMVs中进行;Nsp4编码3C样丝氨酸蛋白酶。除此之外,Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4和Nsp11被证实与PRRSV抑制宿主天然免疫信号通路相关。ORF1b区域编码4个Nsps (Nsp9~Nsp12),Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),Nsp10 是RNA解旋酶,已有研究表明Nsp9 与Nsp10是HP-PRRSV的致病基础。Nsp11具有核酸内切酶活性、去泛素化酶活性、抑制NLRP3炎症小体与调节细胞周期的作用。在整个ORF1b区域,唯有Nsp12的功能尚不明确,目前仅有少数研究报道Nsp12与多个宿主蛋白具有相互作用。但Nsp12在PRRSV复制过程中的作用至今未知。<br />  近日,国际传染病学期刊Emerging Microbes &amp; Infections在线发表中国农业科学院哈尔滨兽医研究所蔡雪辉团队解析PRRSVNsp12功能的相关论文。该研究通过PRRSV反向遗传技术构建Nsp12缺失突变体,该突变体不能拯救出PRRSV,表明Nsp12在PRRSV复制过程中至关重要!该研究进一步对Nsp12蛋白进行生化分析,表明Nsp12蛋白容易被氧化为二聚体以及多聚体,并且这种聚集体的形成与其蛋白序列中的半胱氨酸直接相关。最后,通过一系列试验表明Nsp12参与PRRSV亚基因组mRNA(sgmRNA)的合成,且不影响其全长基因组RNA(gRNA)的合成。通过构建一系列突变体进行的病毒拯救等试验表明,Nsp12的35位与79位半胱氨酸的联合突变影响Nsp12参与病毒sgmRNA的合成。本研究是首次针对PRRSV Nsp12功能的初步解析,然而对于Nsp12参与sgmRNA合成的具体分子机制还有待进一步研究。<br /> 2020年01月25 00:00 2019年12 1295 1295 0 传染性法氏囊病炎症反应的诱因:巨噬细胞转移抑制因子 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20191203 传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)属于双RNA病毒科,双RNA病毒属。该病于1957年发现于美国特拉华州甘步罗地区,因此又被称作甘步罗病。根据IBDV的致病性及抗原变异分析,可将其分为经典毒株、抗原变异株、超强病毒株及弱毒株。IBDV超强病毒株感染主要导致法氏囊损伤及免疫抑制,然而该病毒具体的致病机理仍未完全明确。<br />  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病创新团队近期发表在《Frontiers in microbiology》的一项研究对于传染性法氏囊病炎症反应的诱因进行了一系列研究。该团队发现IBDV超强病毒(vvIBDV)可以通过促进靶细胞分泌巨噬细胞转移抑制因子(MIF),从而介导炎症细胞的迁移及核心炎症因子IL-1β及IL-18在巨噬细胞内的表达上调。<br />  该团队以vvIBDV Gx株为主要研究对象,将Gx株感染SPF鸡后发现其可以导致法氏囊中单核巨噬细胞及异嗜性细胞的迁移,同时这两种细胞中IL-1β和IL-18的转录水平上调。为了探究vvIBDV导致上述炎症反应的原因,该研究利用iTRAQ试验筛选到Gx株感染靶细胞后相比于人工致弱株感染该细胞后显著上调的炎症相关蛋白-MIF分子。为了验证筛选结果,将Gx株感染SPF鸡后检测MIF在法氏囊组织中的转录及表达水平,结果显示感染组与对照组相比,前者MIF的转录及表达水平均显著上调。由于MIF分子主要分泌至细胞外起促炎症作用,为了检测Gx株感染是否上调MIF的分泌水平,将Gx株感染DT40细胞(B淋巴细胞系)及法氏囊原代B淋巴细胞并检测二者上清中MIF的分泌情况,结果显示两种细胞感染组MIF分泌水平在感染早期均显著上调。<br />  为了确定vvIBDV感染导致靶细胞分泌的MIF是否具有促进炎症细胞迁移的作用,首先通过Transwell试验证实了MIF蛋白或Gx感染的DT40细胞上清可以促进外周血单个核细胞(PBMC)的迁移。利用MIF多种抑制剂及MIF抗体处理Gx感染的DT40细胞上清可以抑制vvIBDV感染的DT40细胞上清对PBMC迁移的促进作用,表明Gx株感染DT40细胞后通过分泌MIF促进PBMC的迁移。<br />  为了确定被vvIBDV感染的靶细胞分泌的MIF是否具有促细胞中IL-1β和IL-18上调的功能,首先通过qPCR检测Gx株感染的DT40细胞上清或MIF蛋白处理的巨噬细胞中的IL-1β和IL-18转录水平,结果显示vvIBDV感染细胞上清及MIF蛋白均可以上调IL-1β和IL-18的转录。将MIF抗体及多种抑制剂作用于vvIBDV感染的DT40细胞上清,可见感染细胞中IL-1β及IL-18的转录水平均被显著抑制。表明Gx株感染靶细胞后通过分泌MIF是IBDV感染后IL-1β和IL-18转录上调的原因之一。<br />  目前,免疫抑制病是导致禽类死亡率上升及其产蛋率下降的重要原因之一,是制约养禽业发展的重要因素。该研究初步揭示了vvIBDV通过分泌MIF蛋白导致炎症反应的机理,为阐明vvIBDV的致病机制提供了参考依据。<br /> 2020年01月25 00:00 2019年12 1296 1296 0 黄芩苷通过Nrf2/HO-1防御通路有效抑制鸡毒支原体感染引起的鸡胸腺结构破坏及氧化应激与细胞凋亡 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20191204 支原体是能够进行胞外自我复制的最小原核生物,大多具有致病性。其中鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是鸡慢性呼吸道病和火鸡传染性窦炎的主要病原,引起呼吸道炎症和免疫力下降。该病发展缓慢,病程较长,成年鸡多为隐性感染,病原可在鸡群中长期存在,环境应激即可促使该病暴发和蔓延,给养禽业造成重大的经济损失。目前认为,侵入的MG在宿主呼吸道上皮组织的黏附,其对定植部位宿主细胞的损害及引起机体免疫失调是其致病的主要原因,但MG感染导致家禽免疫失调的潜在机制仍不清楚。胸腺为鸡体的重要淋巴器官,是T细胞分化、发育、成熟的场所,其功能与机体免疫抗感染紧密相关。黄芩苷是从植物黄芩中提取的黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抗炎、调节细胞凋亡与自噬及抗氧化应激等广泛的药理活性,但其抗MG感染所致的免疫损伤的作用及机制尚不明确,有待于进一步研究。<br />  近期发表于《Veterinary Research》杂志的研究论文“Baicalin mitigated Mycoplasma gallisepticum-induced structural damage and attenuated oxidative stress and apoptosis in chicken thymus through the Nrf2/HO-1 defence pathway”,首次报道了MG感染可以引起鸡胸腺结构损伤。组织病理学检查结果显示,MG感染组鸡胸腺细胞排列不紧密,出现炎性细胞浸润和核碎片堆积,皮质与髓质边界不清晰。与正常对照组比较,MG感染组鸡胸腺的抗氧化指标CAT、SOD 和GSH-Px活性明显降低,MDA和γ-GT活性明显增加;细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8活性增强;凋亡相关基因(Cytochrome-C、p53、Bax、Caspase-8、Caspase-3和Caspase-9)的mRNA转录水平和蛋白表达水平明显上调。脱氧核苷酸转移酶末端标记(TUNEL)试验结果显示,MG感染组鸡胸腺的核染色阳性细胞数量增加。此外,电镜检查结果显示,MG感染组鸡胸腺出现染色质凝聚、线粒体肿胀和凋亡小体。然而,黄芩苷治疗可明显减轻由MG感染引起的鸡胸腺细胞氧化应激和凋亡。重要的是,黄芩苷治疗可在一定程度上改善鸡胸腺细胞的异常形态。与MG感染组比较,黄芩苷治疗组鸡胸腺抗氧化指标明显改善,TNF-α活性恢复,凋亡相关基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平显著降低。同时,黄芩苷可显著上调核因子红细胞2相关因子2 (Nrf2)信号通路及其下游基因(Nrf2、HO-1、NQO1、GSTA2、GPX1)的表达,进而抑制MG感染引起的鸡胸腺氧化应激与细胞凋亡。<br />  综上所述,本研究首次证明了黄芩苷是通过激活Nrf2信号通路进而有效抑制MG感染引起的鸡胸腺组织氧化应激和细胞凋亡,并能够维持胸腺组织结构完整性,从而保护细胞的免疫功能。本研究为黄芩苷抗菌活性的研究提供了新的思路,也将有助于后续对多重信号通路与中药抗细菌感染关系的研究。 2020年01月25 00:00 2019年12 1297 1297 0 半胱氨酸蛋白酶ApdS介导猪链球菌免疫逃逸的分子机制 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20191205 猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人兽共患病原菌,不仅对养猪业造成了重大经济损失,也对全球的公共卫生安全构成了严重威胁。自1968年丹麦首次报道该菌感染人类以来,已在亚洲、北美和欧洲等70多个国家和地区发生了1 600起猪链球菌感染人的案例。猪链球菌可经皮肤伤口和呼吸道侵入血液,在血液中存活并大量增殖,从而引发严重的菌血症,并经血液循环感染多个靶器官。猪链球菌抵抗和逃避宿主天然免疫防御的杀伤,是其在血液中存活、感染和致病的关键因素。<br />  近年来发现,Cathelicidin LL-37在抵抗病原菌侵入和调控天然免疫应答过程中发挥了重要作用。LL-37 表达分泌于皮肤角质细胞、上皮细胞以及嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和NK细胞等免疫细胞。猪链球菌在感染侵入机体过程中始终要对抗LL-37的杀伤。然而,猪链球菌与LL-37的生物学关系以及该菌如何适应和逃避LL-37介导的免疫防御,目前仍不清楚。<br />  近期哈尔滨兽医研究所动物细菌病团队发表于《Journal of Biological Chemistry》的一项研究报道,首次证明了半胱氨酸蛋白酶ApdS在猪链球菌逃避宿主天然免疫防御中发挥重要作用,并揭示了ApdS切割抗菌肽cathelicidin LL-37从而介导猪链球菌免疫逃逸的分子机制。<br />  该研究首先检测了猪链球菌感染过程中宿主LL-37的表达情况,结果显示在猪链球菌2型野生株体外感染嗜中性粒细胞时,LL-37的蛋白表达水平随着感染剂量的增加而上调,提示了LL-37可能在抵抗猪链球菌感染的宿主防御中发挥重要功能;通过荧光定量PCR和western blot分析,结果显示:随着LL-37亚致死浓度的增加,猪链球菌表面蛋白ApdS的mRNA转录水平和蛋白表达水平也显著上调,表明ApdS可能参与猪链球菌抵抗和逃逸LL-37的杀伤。在探究ApdS介导猪链球菌免疫逃逸的分子机制方面,该研究发现ApdS能迅速靶向并切割LL-37,而当ApdS第26位的半胱氨酸被丙氨酸取代后,ApdS失去了切割LL-37的活性,表明该氨基酸位点为ApdS的活性位点。ApdS切割LL-37后的截短肽显著降低了其对猪链球菌的杀菌活性,这是由于截短肽中二级结构α螺旋含量降低所导致的。同时,敲除猪链球菌的apdS基因后,显著降低了其对LL-37杀伤的抵抗力;而回补该基因后,可以恢复其对LL-37杀伤的抵抗力;该研究指出ApdS蛋白酶对保护猪链球菌逃逸LL-37的杀伤至关重要。<br />  随后该研究又评估了ApdS蛋白酶在猪链球菌抵抗吞噬细胞攻击中的作用,结果显示猪链球菌apdS基因缺失株增加了其对THP-1细胞、嗜中性粒细胞及其形成胞外诱捕网(NETs)杀伤的敏感性,表明ApdS能够协助猪链球菌逃逸宿主天然免疫的杀伤作用。该研究指出,ApdS切割LL-37后,减弱了LL-37对嗜中性粒细胞的趋化性及诱导NETs形成和活性氧(ROS)产生的能力。<br />  该研究揭示了猪链球菌一种新的免疫逃避策略,丰富了当前对于猪链球菌致病机制的认知,同时为猪链球菌抗菌药物的研发提供重要指导。<br /> 2020年01月25 00:00 2019年12 1298 1298 0