中国预防兽医学报 /oa 鸡马立克氏病病毒感染对鸡神经系统损伤的研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190201 为研究不同毒力的鸡马立克氏病毒(MDV)在鸡神经系统中的感染规律及其对神经系统的损伤进程,本研究选用不同毒力的血清1型MDV (MDV-1)病毒株感染4日龄的SPF鸡,在接毒后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d、25 d、28 d和35 d动态检测病毒载量的变化,并对感染后5 d和21 d的不同病毒株感染鸡的脑部和坐骨神经进行组织病理学观察。结果显示,MDV-1强毒株在SPF鸡脑部的复制能力显著高于弱毒株(p&lt;0.05);特超强病毒株BS在脑组织中出现的时间最早,早期复制最快。但不同毒力的MDV-1株在坐骨神经处的复制能力与其毒力无直接的关系。组织病理学观察显示,在感染早期MDV-1强毒株对SPF鸡脑组织的损伤强于弱毒株;在感染后21 d,强毒株和弱毒株造成的脑部损伤存在明显的不同;而在坐骨神经处,强毒株造成的损伤明显强于弱毒株。本研究揭示了不同MDV病毒株在SPF鸡脑和坐骨神经的复制动力学特征和组织病理学特征,为MDV-1在宿主神经系统中的感染、增殖及造成的损伤提供了实验依据。<br /> 2019年02月15 00:00 2019年02 113 117 0 &nbsp; <p>周林宜,张艳萍,孙国荣,张 峰,于正浩,高玉龙,祁小乐,李 凯,王笑梅*,刘长军*<br /></p> 猪链球菌2型安徽分离株多位点序列分型与毒力特征研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190202 为了解安徽地区猪链球菌2型(SS2)临床分离株毒力基因分布、分子分型特征及其与致病性的相关性,本研究收集了58株源自临床患病猪的SS2,应用PCR技术检测其毒力基因:胞外蛋白因子基因(epf)、溶菌酶释放蛋白基因(mrp)和溶血素基因(sly),应用多位点序列分型方法(MLST)对其进行基因分型,并分析其与动物致病性之间的相关性。结果显示,58株分离菌,epf+/mrp+/sly+型为44.83 % (26/58),epf +/mrp-/sly+型为25.86 % (15/58),epf&nbsp; -/mrp+/sly+型为18.97 % (11/58),epf -/mrp-/sly+和epf -/mrp-/sly-型均为5.17 % (3/58)。共分出10种ST型,其中ST1 26株(44.83 %),ST7 18株(31.03 %),ST28 6株(10.34 %),ST117、ST156和ST308均为1株,各占1.72 %,另有4种新发现的ST型,即ST958 2株(3.45 %),ST957、ST959、ST970各1株(1.72 %);分为4种克隆复合物(ST1 complex、ST27 complex、ST87 complex、ST188 complex)。ST1以epf+/mrp+/sly+型为主(69.23 %),其中23株(88.46 %)分离自全身感染病猪;ST7以epf&nbsp; +/mrp-/sly+型为主(55.56 %),其次为epf+/mrp+/sly+型(38.89 %),其中13株(72.22 %)分离自全身感染病猪。通过对斑马鱼、昆明鼠感染试验和LD50的测定,筛选出的6株强毒菌株分为ST1型(2株)和ST7型(4株)。结果表明,epf +/mrp+/sly+是安徽地区SS2的优势毒力基因型,其次为epf +/mrp-/sly+型。获得10种ST型,其中4种为首次发现,并且ST1和ST7为优势型。具有ST1/epf +/mrp+/sly+遗传特征的菌株在临床上均倾向于导致全身感染。本研究结果揭示了安徽地区SS2毒力基因型、MLST遗传特征与毒力、动物临床症状之间的相关性,为开展SS2流行病学研究,区分不同菌株间毒力差异的研究提供参考依据。<br /> 2019年02月15 00:00 2019年02 118 124 0 &nbsp; <p>张燎原,陈 章,汪清峰,王 玮,孙 裴,魏建忠,李 郁*<br /></p> 利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190203 为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/PtufA-cre质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。<br /> 2019年02月15 00:00 2019年02 125 130 0 &nbsp; <p>刘 冉<sup>1,2</sup>,陈福广<sup>2</sup>,陈 平<sup>2</sup>,黄萌萌<sup>2</sup>,朱金鲁<sup>2</sup>,谢 芳<sup>2</sup>,孟庆文<sup>2</sup>,<br />刘思国<sup>2</sup>,刘建华<sup>1*</sup>,张跃灵<sup>2*<br /></sup></p> 江淮地区猪链球菌和肠球菌分离株的鉴定、分型及药物敏感性分析 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190204 &nbsp; <p>为了解江淮地区猪链球菌(SS)和肠球菌分离株的血清型或基因型分布特征及临床耐药性,本研究对江淮地区临床病例196株分离菌进行SS与肠球菌的鉴定,采用PCR方法进行SS及其1、2、7、9血清型和mrp、ef、sly毒力基因型鉴定;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析SS和肠球菌基因型;K-B法测定其药物敏感性。结果显示,在196株分离菌中,鉴定出112株SS,40株肠球菌。血清型2型SS 44株(39.3 %)为优势血清型,ef -/ mrp-/sly -型SS 36株(32.1 %)为优势毒力基因型,Ps28 18株(16.1 %)和Ps27 14株(12.5 %)为优势PFGE基因型。肠球菌中屎肠球菌21株(52.5 %)为优势菌,Pe12 9株(22.5 %)和Pe7 7株(17.5 %)为肠球菌优势PFGE基因型。SS和肠球菌对20种药物均表现出不同程度的耐药,耐8种以上药物的菌株数分别占85.7 % (96/112)和95 % (38/40)。结果表明,江淮地区SS和肠球菌种型复杂,已经成为引起猪细菌性疾病的重要致病菌。分离菌株PFGE基因型均呈多态性,在传播过程中可能存在遗传变异。SS PFGE基因型与血清型、毒力基因型不呈现相关性。菌株耐药现象严重,多重耐药普遍,且耐药谱越来越广。本研究为江淮地区SS和肠球菌的分子流行病学研究及相关疫病防控提供科学依据。<br /> </p> 2019年02月15 00:00 2019年02 131 137 0 杨龙斌,毛天骄,吴华健,焦安心,孙 裴,魏建忠,李 郁*<br /> 狐肺炎大肠杆菌毒力基因和耐药基因检测及药物敏感性分析 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190205 为了解河北地区狐肺炎大肠杆菌毒力基因、耐药基因的分布及耐药性情况,本研究采用PCR技术对从狐肺炎病例分离的81株大肠杆菌的毒力基因和耐药基因进行检测,采用K-B法检测这些大肠杆菌对16种抗菌药物的敏感性,采用试管二倍稀释法检测中药对大肠杆菌的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),采用腹腔注射法检测81株大肠杆菌对小白鼠的致病性。结果显示:此次共分离到81株大肠杆菌,且对小白鼠具有较强致病性;毒力基因irp2、fyuA、Ler、eaeA检出率分别为50.6 %、56.8 %、9.9 %、23.5 %;耐药基因blaTEM、blaOXA1、sul1、sul2、blaTEM1、blaSHV-1、blaCTX-M、strA-strB、aadA1、blaPSE1、sul3、tetA、tetB、tetC、tetD、ermF检出率分别为84.0 %、69.1 %、43.2 %、38.3 %、28.4 %、4.9 %、24.7 %、29.6 %、16.1 %、9.9 %、11.1 %、9.9 %、18.5 %、8.6 %、13.6 %、3.7 %,未检出耐药基因ermB、ermC;81株大肠杆菌均对磺胺间甲氧嘧啶、林可霉素等耐药;诃子、乌梅、五味子对81株大肠杆菌具有较好的体外抑菌作用,抑菌圈直径在20 mm~36 mm,MIC和MBC在7.81 mg/mL~62.50 mg/mL。本研究调查了河北地区狐肺炎大肠杆菌的流行情况,对狐肺炎病的防治具有重要的指导意义,更具公共卫生学意义。 2019年02月15 00:00 2019年02 138 144 0 &nbsp; <p>朱利霞<sup>?</sup>,王洪彬<sup>?</sup>,赵希艳,王双月,史秋梅*,高光平*<br /></p> 两株草鱼源维氏气单胞菌菌株的主要表型特征及致病力比较 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190206 维氏气单胞菌(A.veronii)是严重危害草鱼的一种病原。本研究从电镜观察、Biolog 微生物自动分析仪鉴定、细菌游动能力、胞外产物活性、细胞黏附性、对草鱼致病力和毒力基因等方面,比较草鱼源A.veronii菌株 GZ09007 和 FS12001 的表型特征和致病性差异。结果显示,两株细菌菌体均呈短杆状或弧形、两端钝圆,在透射电镜下可见单鞭毛。Biolog微生物自动分析仪鉴定结果显示菌株均为A.veronii,两株细菌均具有游动能力,胞外产物具有溶血活性、溶蛋白活性和脂肪酶活性,但GZ09007的游动能力、溶血活性、蛋白酶活性均显著强于FS12001 (p&lt;0.05)。GZ09007对EPC、CIK细胞黏附性弱,FS12001 的细胞黏附性强,两株细菌的细胞黏附性差异显著(p&lt;0.05)。菌株GZ09007具有aerA、act、lip、ser、exu、fla毒力基因,但未检测到ast、alt、gcaT、ahyB等毒力基因;菌株FS12001具有aerA、act、alt、ast、lip、ser、ahyB、exu毒力基因,但未检测到gcaT、fla毒力基因。两株细菌均可以造成草鱼发病死亡,GZ09007对草鱼的LD50为5.6×106 cfu,而FS12001的LD50则高于1.5×108 cfu。表明 GZ09007为强毒株,FS12001为弱毒株。推测A.veronii胞外产物的溶血活性和溶蛋白活性在其感染和致死草鱼过程中起到了关键作用。本研究结果为进一步探究A.veronii菌株的致病机理提供依据。<br />   2019年02月15 00:00 2019年02 145 150 0 &nbsp; <p>任 燕,高彩霞,曾伟伟,王 庆,王英英,李莹莹,尹纪元,常藕琴,石存斌<sup>*<br /></sup></p> 猪圆环病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立及应用 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190207 为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×101拷贝/μL~4.78×109拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3 %,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。<br />  2019年02月15 00:00 2019年02 151 155 0 &nbsp; <p>李晓菲,陈 婷,孙爱荣,葛晓杰,黄 艳,徐 婷,王彩宏,魏笑笑,秦立廷*<br /></p> 猪繁殖与呼吸综合征病毒与非典型瘟病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190208 为建立同时快速简便地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与非典型瘟病毒(APPV)两种病毒的方法,本研究根据GenBank中登录的PRRSV、APPV的基因序列,选取PRRSV的ORF2基因和APPV的NS2基因分别设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测PRRSV与APPV的双重RT-PCR方法。利用该方法对PRRSV、APPV重组质粒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒的cDNA和阴性对照进行检测,结果显示除PRRSV和APPV重组质粒扩增结果为阳性外,其余均为阴性,表明其特异性良好;该方法对APPV和PRRSV质粒标准品的最低检出量分别为2.17×104拷贝/μL 、3.13×103拷贝/μL,敏感性较高;同时批间和批内重复性试验表明该方法重复性好。利用该方法对四川地区临床73份疑似仔猪颤抖病与猪繁殖与呼吸综合征病的病料样品进行检测,结果与单一RT-PCR的检测符合率为100 %。本研究建立的双重RT-PCR方法具有良好的实用性,可用于临床样品的检测,对临床早期诊断具有重要意义。<br />   2019年02月15 00:00 2019年02 156 160 0 &nbsp; <p>冯 宇<sup>1</sup>,杨晓宇<sup>1</sup>,赵 军<sup>1</sup>,李雨濛<sup>1</sup>,徐志文<sup>1,2*</sup>,朱 玲<sup>1,2<br /></sup></p> 猪猝死症4种重要病原多重连接探针扩增鉴别检测技术的建立与应用 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190209 为了快速检测引起猪猝死的病原,本研究针对临床引起猪猝死症的4种疾病病原(猪尼帕病毒、非洲猪瘟病毒、猪产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌)分别设计特异性探针,建立了同时检测这4种病原的多重连接探针扩增技术(MLPA)。对扩增产物进行毛细管电泳分析,结果显示该方法,探针之间没有交叉反应,特异性强。对不同病原核酸的最低检测限可以达到140拷贝μ/L~370拷贝μ/L,敏感性较高。应用该MLPA方法对129份临床样品进行检测,并与国家相关标准进行比较。结果显示,两种方法的符合率为100 %,且该方法检测猪产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的特异性和敏感性均达到100 %,Kappa值均为1。该方法的检测结果与国家或行业标准PCR的检测结果一致性较高,且克服了后者无法同时进行多重检测的缺点,最多可以同时检测45种病原,对于复杂症候群的快速和高通量检测具有重要临床意义。该方法可推广到其它多重病原体的检测中,显示出广阔的应用前景。<br />   2019年02月15 00:00 2019年02 161 167 0 &nbsp; <p>周莹珊<sup>1†</sup>,陈 琳<sup>1†</sup>,孙 静<sup>1</sup>,姜 胜<sup>1</sup>,邵春艳<sup>1</sup>,周 彬<sup>1</sup>,宋泉江<sup>1</sup>,<br />黄保续<sup>2</sup>,王晓杜<sup>1*</sup>,宋厚辉<sup>1*<br /></sup></p> 口蹄疫病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190210 为建立一种简单、快速、特异的口蹄疫病毒(FMDV)分子检测方法,本研究基于FMDV的3D基因,设计特异性引物和exo探针,建立了用于FMDV快速检测的等温实时荧光反转录重组酶聚合酶(Real-time RT-RPA)方法。该方法采用便携式等温扩增仪-Genie III实时监测扩增结果,40 ℃ 20 min即可完成检测。结果显示,FMDV RT-RPA方法能够特异性扩增FMDV 3D基因,而对水泡性口炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、脑心肌炎病毒等均无扩增;以体外转录的FMDV 3D RNA作为模板,该方法在95 %置信区间检出下限为1.0×102拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于1 %;使用43份含有灭活FMDV的模拟临床样品分析显示,RT-RPA对FMDV的检出率为34.9 % (15/43),略低于荧光定量RT-PCR的检出率(39.5 %,17/43),而两种方法的符合率为95.3 % (41/43)。RT-RPA能够在6 min~16 min内完成检测,而实时荧光RT-PCR则需要30 min~51 min。本研究所建立的实时荧光RT-RPA方法反应快速,特异性强,灵敏性高,操作简单,结合便携式具有荧光检测功能的等温扩增仪Genie III,组建了FMDV快速检测平台,在基层兽医部门,尤其在野外及疫情现场的FMDV检测中具有极大的应用潜力,为设备仪器有限的实验室和田间对FMDV的快速检测提供了一种有效的方法,对于条件有限地区FMD的防控具有重要意义。<br />   2019年02月15 00:00 2019年02 168 173 0 &nbsp; <p>刘立兵<sup>1,2†</sup>,王金凤<sup>1,2†</sup>,张若曦<sup>3</sup>,石蕊寒<sup>1,2</sup>,韩庆安<sup>3</sup>,李睿文<sup>4</sup>,王建昌<sup>1,2*</sup>,袁万哲<sup>4*<br /></sup></p> 猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫组化试验中的初步应用 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190211 为制备猪圆环病毒3型(PCV3) Cap蛋白单克隆抗体(MAb),并初步应用于感染细胞或组织样品中PCV3抗原的间接免疫荧光试验(IFA)或免疫组化(IHC)检测,本研究将PCV3 Cap蛋白的去核定位信号肽基因克隆于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导表达了具有免疫原性的融合蛋白。以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,共获得8株能够稳定分泌针对PCV3 Cap蛋白的MAb杂交瘤细胞株。Western blot与IFA试验结果显示,8株MAbs均能够与真核表达的重组Cap蛋白反应。选取3株杂交瘤细胞制备3株MAbs,小鼠腹水效价分别为1∶409 600、1∶204 800和1∶409 600。利用3株MAbs对自然感染PCV3临床病猪的腹股沟淋巴结进行IHC检测,结果显示3株MAbs的腹水均能够与感染PCV3的临床样品发生特异性的免疫反应。本研究制备的MAbs具有较好的特异性,为深入研究Cap蛋白的结构和PCV3快速诊断奠定了基础。<br />   2019年02月15 00:00 2019年02 174 178 0 &nbsp; <p>赵 冬<sup>1,2,3,4,5</sup>,王小波<sup>1,2,3,4,5</sup>,高清清<sup>1,2,3,4,5</sup>,郇长超<sup>1,2,3,4,5</sup>,王万彬<sup>6</sup>,<br />高 崧<sup>1,2,3,4,5,6*</sup>,刘秀梵<sup>1,2,3,4,5<br /></sup></p> 猪PBD1成熟肽基因在干酪乳酸杆菌中的表达及其抑菌活性的检测 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190212 为获得一株能够稳定表达猪β防御素-1 (PBD1)成熟肽蛋白的重组干酪乳酸杆菌,本研究将PBD1成熟肽基因克隆至含有短小干酪乳酸杆菌信号肽的pUCK-SP载体中,再将SP-PBD1亚克隆到干酪乳酸杆菌整合性表达质粒pMJ67的Lac启动子下游,获得重组质粒pMJ67-SP-PBD1,电转化入干酪乳酸杆菌,经红霉素抗性筛选和基因组DNA PCR测序鉴定,证实猪PBD1基因整合到了干酪乳酸杆菌中。采用半定量RT-PCR分析显示,经 2 %乳糖诱导18 h后的重组菌中猪PBD1 mRNA含量最高。Western blot检测显示,经乳糖诱导的重组菌表达了约5.8 ku的目的蛋白,与PBD1成熟蛋白理论分子量相符。抑菌试验结果显示重组PBD1对葡萄球菌具有明显抑制作用。表明猪PBD1基因在重组干酪乳酸杆菌中获得了表达,且具有抑菌活性。本研究为进一步研发具有广谱抗菌作用的微生态制剂奠定了基础。<br /> 2019年02月15 00:00 2019年02 179 183 0 &nbsp; <p>杨兴武<sup>1?</sup>,郭 奎<sup>1,2?</sup>,韩昊莹<sup>1</sup>,赵 宇<sup>1</sup>,郑慧华<sup>1</sup>,杨明凡<sup>1,3</sup>,陈红英<sup>1,3*<br /></sup></p> 牛多杀性巴氏杆菌znuA基因的原核表达及其免疫保护作用的研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190213 为研究牛多杀性巴氏杆菌(P.multocida)高亲和力锌吸收蛋白znuA的免疫学活性及其免疫保护作用,本研究利用 PCR方法扩增了P.multocida znuA基因,构建表达载体 pET-28a-znuA,将其转化E.coli BL21 后经诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白约 40 ku;以重组znuA蛋白免疫小鼠后用P.multocida菌株Y-1攻毒,结果显示重组znuA蛋白对免疫组小鼠保护率为 60 %,表明其具有免疫保护作用。本研究首次在原核系统中表达了P.multocida znuA蛋白,且验证了其免疫保护力,为深入探究znuA基因在P.mul- tocida致病过程中的作用及其亚单位疫苗的开发奠定了基础。<br />   2019年02月15 00:00 2019年02 184 187 0 &nbsp; <p>嵇少泽,高云航*,勾长龙,张喜庆,田佳琪,李 晨,王思月<br /></p> 产气荚膜梭菌β毒素蛋白抗原表位预测及CPB-N蛋白免疫原性分析 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190214 为获得具有与β毒素蛋白相同免疫原性的新蛋白,本研究对产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列进行综合分析,预测其抗原表位并筛选出有效的新蛋白。采用生物信息学方法综合分析β毒素蛋白二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、跨膜区域以及信号肽,同时参考ElliPro服务器在线预测。最终预测aa108~aa320区段为优势抗原表位,在此基础上建立β毒素蛋白三维结构模型,标记特殊位点并筛选出B型产气荚膜梭菌新蛋白(CPB-N)。诱导表达CPB-N后通过SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示在约24 ku处有明显条带。采用间接 ELISA 方法对免疫小鼠的血清和肠道灌洗液样品进行检测,结果表明CPB-N与β毒素蛋白的免疫原性基本相同。CPB-N蛋白的筛选及预防产气荚膜梭菌引起的疾病奠定了重要的研究基础。<br />  2019年02月15 00:00 2019年02 188 191 0 &nbsp; <p>王玉建<sup>1</sup>,商红旗<sup>1</sup>,朱 琳<sup>1</sup>,徐煜琳<sup>1</sup>,胡莉萍<sup>2*</sup>,朱瑞良<sup>1*<br /></sup></p> 重组腐败梭菌α毒素的制备与免疫效力评价 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190215 &nbsp;为了对重组腐败梭菌α毒素的免疫效力进行评价,本研究以表达重组腐败梭菌α毒素的大肠杆菌BL21(pET28a-CSA)为研究对象,对影响重组腐败梭菌α毒素表达量的条件优化后,将重组腐败梭菌α毒素(分为上清分泌形式与包涵体形式)、超声波裂解和未裂解诱导后的全菌制成铝佐剂灭活疫苗皮下注射免疫家兔后,检测家兔血清中和效价,利用1 MLD腐败梭菌毒素攻击免疫家兔。结果显示,pET28a-CSA/BL21培养至OD600nm达到0.850~0.950时以0.40 mmol/L IPTG,37 ℃诱导6 h获得的重组腐败梭菌α毒素相对表达量较高,并且以包涵体和可溶性2种形式表达且以包涵体居多;除包涵体疫苗组血清中和抗体效价为6 MLD/0.1 mL外,其它可溶性、裂解菌苗和未裂解处理菌苗实验组均为8 MLD/0.1 mL,高于类毒素疫苗组和《中国兽药典》规定的1 MLD/0.1 mL,攻毒后各免疫组家兔均得到100 %保护,而类毒素疫苗组保护率仅40 %,空白对照组全部死亡。结果表明,本研究制备的重组腐败梭菌α毒素具有很好的免疫保护效果,尤以可溶性的重组腐败梭菌α毒素免疫保护最佳。本实验为羊快疫疫苗的研制提供了实验基础。 <br />   2019年02月15 00:00 2019年02 192 195 0 &nbsp; <p>彭国瑞,彭小兵*,李旭妮,董令赢,蒋玉文*<br /></p> 牛源金黄色葡萄球菌凝固酶分型与致病因子检测 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190216 为了解青海和甘肃地区奶牛养殖场的金黄色葡萄球菌(S.aureus)基因型分布状况,本研究对来自该两个地区的210份奶样进行了S.aureus的分离与鉴定,利用凝固酶基因(Coa)扩增和限制性内切酶AluⅠ酶切方法对所有分离株进行了凝固酶多态性分型。并对不同凝固酶基因型的S.aureus进行了白细胞毒素F (LukF)、白细胞毒素S (LukS)、α溶血素(α-hemolysin)、β溶血素(β-hemolysin)等主要致病因子检测。结果显示,共分离鉴定出35株S.aureus (青海13株,甘肃22株),所有分离株均能够扩增出Coa基因片段,并有5种PCR分型结果(本文简称PCR1~PCR5型),其中PCR 1、4和5型只有1种亚型,而PCR 2型有3种亚型,PCR 3型有2种亚型。PCR 3型是青海(6/13)和甘肃地区(8/22)主要流行的基因型。致病因子检测结果显示,所有分离株均携带致病因子LukS和α溶血素;致病因子LukF和β溶血素检出率也很高,分别是30株(85.7 %)和31株(88.6 %)。β溶血素基因在甘肃地区检出率为95.5 % (21/22),青海地区检出率为76.9 % (10/13),致病因子LukF在甘肃地区检出率为91.0 % (20/22),青海地区检出率为76.9 % (10/13),且在各基因型中均有分布,甘肃地区S.aureus致病因子LukF和β溶血素检出率高于青海地区。本研究首次对青海和甘肃地区致奶牛乳房炎S.aureus进行了鉴定分析,为这两个地区奶牛乳房炎的防治提供了参考依据。<br />  2019年02月15 00:00 2019年02 196 199 0 &nbsp; <p>徐 结,侯 晓,张雪婧,蒲万霞*<br /></p> 成都地区猫传性腹膜炎病毒ORF3、7b以及S基因七肽重复区1序列的分析 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190217 猫传性腹膜炎(FIP)是由猫冠状病毒引起的猫科常见致死性传染病。为分析成都地区猫传性腹膜炎病毒(FIPV)部分基因的序列特征,本研究从11只FIP患猫的腹水中提取总RNA,采用普通PCR或套式PCR对FIPV的非结构蛋白基因ORF3 (3a、3b和3c)、7b以及S基因七肽重复区1 (HR1)序列进行PCR扩增并测序。结果显示:检测到FIRV的上述几个基因均呈遗传多样性,序列存在很大的个体间差异。3a和3b基因主要表现为氨基酸突变,3c基因在约89 %的样品中存在截短。7b基因有7个位点的氨基酸被完全替换。S基因HR1序列融合肽的1045位甲硫氨酸被亮氨酸替换,其下游的1057位丝氨酸被丙氨酸替换。遗传进化树显示,本实验扩增的FIRV 7b及S基因HR1序列与GenBank中国外FIPV相应基因序列亲缘性较高。推测3c基因的截短和/或某些氨基酸的替换的共同作用与病毒的致病性有关。本研究结果为FIP的临床确诊提供了分子诊断依据,增加了临床诊断结果的可靠性。<br />  2019年02月15 00:00 2019年02 200 203 0 &nbsp; <p>吴春霞,卢建远,金素钰,黄 林,郑玉才*<br /></p> 豪猪源福氏志贺菌的分离鉴定及喹诺酮类耐药基因检测 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190218 为调查四川省某规模化豪猪养殖场中豪猪大面积腹泻死亡的原因,本研究采集病死豪猪的肠道内容物和肺脏等病料样品进行细菌的分离纯化,通过培养特性观察、革兰染色镜检、生化鉴定、16S rRNA基因的克隆测序进行鉴定,并对分离菌株进行致病性、耐药性分析,对其喹诺酮类耐药基因进行PCR检测并测序分析。结果显示,分离得到1株革兰阴性菌,该分离株符合福氏志贺菌的培养特性和生化特性,并且其16S rRNA基因序列与福氏志贺菌该基因序列的同源性为99 %;对小鼠具有较强致病性;药敏试验结果显示分离株具有多重耐药性,仅对丁胺卡那敏感,对喹诺酮类、四环素类、头孢类、氨基糖苷类、青霉素类和氯霉素类药物均表现为耐药;分离株的DNA促旋酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ的喹诺酮耐药决定区均有突变,且携带有质粒介导的喹诺酮耐药基因qnr A和qnr S。本研究是国内首次关于豪猪源福氏志贺菌病的报道,为豪猪养殖中该细菌性疾病的诊断防治等相关研究提供参考。<br />   2019年02月15 00:00 2019年02 204 208 0 &nbsp; <p>张鹏飞<sup>1</sup>,王 印<sup>1,2*</sup>,德西措姆<sup>3</sup>,杨泽晓<sup>1,2</sup>,姚学萍<sup>1,2</sup>,罗 燕<sup>1,2</sup>,廖倡宇<sup>1,2<br /></sup></p> 产志贺毒素大肠杆菌检测技术研究进展 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190219 2019年02月15 00:00 2019年02 209 213 0 &nbsp; <p>杨 斌<sup>1,2†</sup>,邹 杰<sup>1,2†</sup>,羊 扬1,2*,朱国强1,2*<br /></p> 肠外致病性大肠杆菌LuxR家族转录调节蛋白YjjQ研究进展 /oa/darticle.aspx?type=view&id=20190220 2019年02月15 00:00 2019年02 214 217 0 &nbsp; <p>傅丹丹,肖亚婷,祁克宗*,宋祥军,涂 健,薛 媚<br /></p> 蝙蝠汉坦病毒“自然传播圈”的发现 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20190201 汉坦病毒(HV)是严重威胁人类健康的重要人兽共患病原体。啮齿动物是该病原公认的自然宿主和传播动物,人感染后引起肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)和汉坦病毒心肺综合征(Hantavirus cardiopulmonary syndrome,HCPS)二种疾病。前者主要在欧亚大陆流行,而后者主要在美洲流行。每年全球报告约10万例肾综合征出血热和近千例汉坦病毒心肺综合征。我国是肾综合征出血热流行比较严重的国家,仅2017年发病人数就高达11 262例,其中死亡病例64人。<br />  蝙蝠是自然界携带病毒最多的自然宿主,目前从蝙蝠体内鉴定出的致病病毒或具有潜在健康威胁的病毒超过300种,但是绝大多数蝙蝠病毒的分布与传播特点并不清楚。自2012年首次发现蝙蝠HV以来,目前已经从欧亚大陆和非洲蝙蝠体内鉴定出多种新型HV,它们与啮齿动物HV的基因序列同源性较低,只有43.3 %~66.6 %。这些蝙蝠HV的发现引起了学界高度关注,但它们在自然界的分布、传播及其健康风险并不清楚。近期《PLoS Pathogens》发表了由军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所涂长春团队完成的研究论文。作者采用高通量测序技术对2012年~2016年间采集自云南、广西、广东、浙江、福建等省的6科22个种1 419份蝙蝠组织样品进行了病毒宏基因组测定,对鉴定出的蝙蝠HV进行了样品筛查和全基因组序列测定,同时对采集的709份蝙蝠血清进行蝙蝠HV血清流行病学调查。此外,还采用ELISA、Western blot和病毒中和试验,对蝙蝠HV与感染人的HV(首尔病毒,SEOV)进行抗原交叉性分析。结果发现云南东南、广西西南与越南北部交界的地区是蝙蝠HV流行比较集中的地域,首次提出蝙蝠HV“自然传播圈”的概念。研究发现区域内至少流行着2种蝙蝠HV,即来宾病毒(LAIV)和玄松病毒(XSV),病毒感染阳性率2.6 %~9.1 %,血清抗体阳性率5.5 %~35.9 %,而且蝙蝠群中普遍存在不同HV的混合感染。进一步用N蛋白进行的抗原交叉分析发现LAIV与XSV、XSV与SEOV之间存在明显的抗原交叉,而LAIV与SEOV之间没有抗原交叉。血清中和试验还发现部分阳性蝙蝠血清能中和SEOV。这一结果首次证明蝙蝠HV与感染人的HV存在明显的抗原交叉特性,表明蝙蝠HV可能是人类潜在的新发病原体。<br />  目前国际病毒分类委员会(ICTV)批准的蝙蝠HV只有2种,该项研究测定了最多的蝙蝠汉坦病毒全基因组序列,提出全球蝙蝠HV可分为9个种的新分类建议。作者还发现蝙蝠HV具有高度的宿主专一性,即每一种蝙蝠HV只感染一个蝙蝠属的成员作为其自然宿主。论文成果全面揭示了全球蝙蝠HV的遗传多样性与宿主嗜性,首次提出蝙蝠HV“自然传播圈”的概念,明确了蝙蝠HV与感染人的HV具有明显的抗原交叉特性。该研究结果不仅丰富了科学界对蝙蝠HV的认识,而且对进一步阐明这些新病毒的公共卫生意义具有重要的学术价值。 2019年02月15 00:00 2019年02 218 218 0 CHOP调控内质网应激介导细胞凋亡的机制 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20190202 C/EBP同源蛋白CHOP是一种29K的细胞蛋白,主要参与调控细胞增殖、分化以及能量代谢等。CHOP作为转录因子在内质网应激(ER Stress,ERS)介导的细胞凋亡中起重要作用。ERS通常是指ER中错误折叠或未折叠蛋白质增加引起的应激反应。发生ERS时,细胞会通过未折叠蛋白反应(UPR)维持细胞内稳态。长期或过度的应激会导致ER功能障碍和凋亡发生。ER通过3个主要途径诱导细胞凋亡,包括IRE1/ASK1/JNK途径、Caspase-12激酶途径和CHOP途径。其中CHOP途径在病原微生物感染、神经系统疾病和肿瘤性疾病引起的细胞凋亡中起重要作用。<br />  细胞凋亡是一个由基因控制的程序性细胞死亡过程,主要分为线粒体途径、死亡受体途径和ERS诱导的凋亡途径。CHOP在ERS诱导的细胞凋亡中起重要作用。在病理状态或微生物感染时CHOP表达快速上升,细胞凋亡被激活,该过程主要受蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、激活转录因子6(ATF6)和肌醇需要蛋白1 (IRE1) ER内膜3个感受器调控。PERK是一种抑制蛋白翻译、调节氧化应激以及参与不饱和聚酯反应的重要传感器。内质网中的未折叠蛋白刺激PERK自磷酸化和寡聚化,并能磷酸化真核翻译起始因子2α (eIF2α)促进ATF4的转录,激活PERK/ATF4/CHOP信号通路,诱导细胞凋亡。ATF6在ERS时被剪切和激活,随后以同源或异源二聚体形式入核,与ATF/cAMP以及ER反应元件相互作用,并与UPR基因(如CHOP、GRP78、XBP1)启动子结合而启动转录,通过靶基因增强ER的蛋白折叠能力。IRE1含有蛋白激酶和RNA酶活性。未折叠蛋白刺激IRE1-α自磷酸化和寡聚化而激活RNA酶活性,降解抑制mRNA表达的microRNA;同时活化XBP-1蛋白,参与调节CHOP等基因的表达。IRE1α可刺激凋亡信号激酶-1 (ASK1)的激活,进而激活JNK和p38有丝分裂原激活蛋白激酶(p38-MAPK)引起凋亡。CHOP的下游调控途径包括:1)线粒体依赖途径。多种上游促凋亡信号作用于线粒体膜,使其形成蛋白质通道促成促凋亡活性物质(如细胞色素C、Smac等)被释放到细胞质中,激活下游Caspase-9引发细胞凋亡。2)CHOP通过死亡配体(Fas,TNF-α和Trail)招募外源性凋亡受体,激活细胞质Caspase-8以及下游Caspase-3,诱导细胞凋亡。3)CHOP增加ERO1-α (ER还原酶)基因表达,催化蛋白质二硫化物异构酶氧化并产生H2O2,引起ROS的产生以及凋亡和炎症反应发生。此外,CHOP与氨基酸饥饿、ER应激和微生物感染引起的自噬也有关。在氨基酸饥饿和ER应激时,CHOP能在初期上调自噬相关基因表达以缓解氨基酸代谢应激,而在后期则抑制自噬并逐渐启动凋亡。此外,CHOP还通过下调P53-P21或细胞周期素Cyclin D使细胞周期停滞,引起凋亡发生。<br />  多种微生物通过调节CHOP表达使感染宿主细胞发生凋亡。例如传染性支气管炎病毒感染激活UPR的IRE1α-XBP1以及PERK/PKR-eIF2-α-ATF4途径诱导细胞凋亡,进而有利于病毒复制。在结核分枝杆菌感染过程中,CHOP过度表达促进细胞凋亡,有利于抗感染。微生物感染引起的ERS和凋亡在细胞抗感染调节中起着关键作用。CHOP是ERS诱导细胞凋亡的重要分子,然而其诱导的细胞凋亡是否有利于病原微生物感染,或触发更强烈免疫反应的机制尚不清楚。因此,深入研究病原微生物利用CHOP诱导细胞凋亡的功能将有助于阐明微生物的胞内感染机制。<br />  近期发表于《Frontiers in Immunology》的综述,首次对CHOP调控内质网应激介导细胞凋亡的机制进行了阐述,通讯作者为中国农业科学院上海兽医研究所于圣青研究员。 2019年02月15 00:00 2019年02 219 219 0 伪狂犬病毒的病原生态学以及进化最新研究 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20190203 伪狂犬病病毒(PRV)于20世纪初发现,自20世纪80年代以来一直在全球范围流行,现在至少在44个国家或地区报道PRV阳性。猪是其自然宿主,引起猪的Aujeszky病,可导致母猪繁殖减少,成年猪呼吸道疾病,神经系统紊乱以及仔猪死亡率高。2011年中国首次报道了变异型PRV引起多个已接种PRV减毒活疫苗的猪场再次爆发疾病,对养猪业造成较大的危害。同时该病毒还可以感染许多其他动物,如反刍动物,食肉动物和啮齿动物等,2018年首次证实PRV感染养猪场工人,并造成不可逆性视神经损伤,其频繁的跨宿主传播也对公共卫生构成潜在威胁。<br />  PRV是一种α疱疹病毒,具有较大的基因组(大于140 kb),编码超过100种蛋白质。病毒包膜蛋白,糖蛋白B (gB)、gC、gD、gE参与受体结合,致病性和抗体的诱导,它们适合于研究PRV的系统发育和流行病学特征。之前的研究大多基于gC基因,展开对PRV的系统发育分析,并鉴定出2种主要的PRV基因型。我国所流行的毒株主要为2型病毒,其他国家主要为1型病毒。然而,由于不同地区PRV的种间传播和进化是不同的,直到现在,还没有深入研究PRV的多样化模式和进化动态。同时PRV具有频繁的跨宿主传播能力,并且在跨宿主传播过程中的适应性进化也尚未明确。<br />  近期发表于《Journal of Infectious Diseases》的一项研究结果显示,从全基因,gB、gD、gE和gC基因角度分析PRV均被分为2种基因型,并且,中国存在两种基因型PRV,同时2型PRV几乎全部来自中国,流行情况较为严峻。基于gC基因可以将PRV细分为基因型1,基因型2.1和基因型2.2,而中国2011年之后主要报道的变异型PRV属于基因型2.2,并且发现PRV变异毒株在2011年报道之前就已经在我国猪群中存在。此外,PRV在其进化历程中经历了频繁的重组,其中既存在基因型内部的重组也存在基因型之间的重组,包括我国目前流行的PRV2.2型毒株(变异株)与基因1型毒株(疫苗毒株)之间的多种重组,这些重组可能会导致PRV的毒力变异和疫苗免疫的失败。该研究发现两种基因型均分别独立流行了较长时间。此外,该研究首次通过选择分析,适应性进化分析结合结构生物学等多种方法鉴定出PRV一些重要糖蛋白gB、gC、gD和gE中的正选择和跨宿主传播的适应性进化氨基酸位点,这些位点可能与PRV适应新宿主和免疫逃逸有关。<br />  该研究首次系统分析了PRV和我国目前主要流行的PRV变异株的起源、重组、基因分型和流行病学特征,研究了PRV的进化动力学,并首次构建我国PRV变异毒株的流行病学动力学模型,发现PRV变异毒株在我国猪群中未来仍然有持续的流行风险,通过选择压力结合氨基酸位点分析发现了PRV糖蛋白上的适应性进化位点,为我国PRV变异毒株的疫苗研发和防控提供了新的理论依据。<br /> 2019年02月15 00:00 2019年02 220 220 0 禽白血病病毒J亚群诱导CD117+chB6+前体B细胞克隆无能引起机体免疫耐受 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20190204 禽白血病病毒J亚群(ALV-J)属于反转录病毒科α-反转录病毒属的第10个亚群,由英国学者Payne于1991年分离于肉鸡,之后迅速向全世界传播,在1997年~1998年, ALV-J诱导的髓细胞瘤病在欧美肉种鸡群全面爆发,造成了1/3肉种鸡的损失,有些地区甚至到了无鸡可养的地步。ALV-J垂直传播和水平传播能力均高于其它亚群,其中垂直传播是其扩散的主要途径,病毒经由卵进入子代后,可引起机体产生4种状态,即病毒阳性抗体阴性(V+A-)、病毒阳性抗体阳性(V+A+)、病毒阴性抗体阳性(V-A+)和病毒阴性抗体阴性(V-A-),其中V+A-是感染鸡群的主要状态,称为免疫耐受(又称持续性病毒血症),其主要影响是造成被感染鸡生长迟缓、免疫力持续低下,对各种抗原刺激的应答能力消失,成为诱导髓细胞瘤和其它各种肿瘤形成的必要条件,也是继发感染和混合感染的先决条件。而ALV-J诱导鸡群免疫耐受机制至今未明。<br />  近期,《Retrovirology》发表了“Clonal anergy of CD117+chB6+ B cell progenitors induced by avian leukosis virus subgroup J is associated with immunological tolerance”的研究论文。该作者在研究中注意到,ALV-J先天感染造成子代V+A-状态的比例极显著高于后天感染,因此,推测ALV-J可能是通过抑制胚胎期前体B细胞的发育和分化使机体进入免疫耐受状态。鉴于此,该文作者建立了ALV-J先天感染模型,通过形态和功能进行了B细胞及其前体细胞的发育、分化及免疫能力研究。<br />  结果显示,先天感染鸡的免疫器官,尤其是法氏囊,显著发育不良,IgM-和IgG-阳性细胞数量、总免疫球蛋白水平及抗ALV-J抗体水平明显低于后天感染鸡,大部分法氏囊淋巴滤泡结构模糊,没有分化成皮质与髓质,证明B细胞发育在胚胎早期即被抑制了。流式细胞术筛选检测发现,ALV-J阻滞了法氏囊中一个前体B细胞亚群,CD117+chB6+前体B细胞的发育。进一步,对B细胞及CD117+ chB6+前体B细胞的体液免疫及免疫能力进行了评估,结果显示,前体细胞被抑制后,(1)诱导绵羊红细胞及马立克氏1型弱毒疫苗的抗体滴度明显降低;(2)在脾脏的生发中心,对于胸腺独立的LPS刺激,B细胞增生性应答明显降低;(3)体外,对于LPS和IL-4的刺激,B细胞前体细胞的免疫球蛋白类型转换基因重组能力、细胞的增殖及分化能力显著降低。综上所述,ALV-J诱导的免疫耐受是由CD117+chB6+前体B细胞克隆无能引起。<br />  该研究揭示了ALV-J先天感染鸡的B细胞无能是由于ALV-J抑制了CD117+chB6+前体B细胞发育致使其功能障碍,导致免疫耐受状态的发生。该发现有助于我们进一步了解免疫抑制性病毒诱导免疫耐受的发生机制及致病机制,为有效防控该类疾病奠定了理论基础,但ALV-J诱导前体B细胞克隆无能的分子机制需要进一步研究。<br /> 2019年02月15 00:00 2019年02 221 221 0 不容小觑的新型猪圆环病毒:中国部分地区PCV3分子流行病学调查 /oa/darticle.aspx?type=view&id=研究进展评述20190205 猪圆环病毒3型(PCV3)作为一种新发现的圆环病毒,对养猪业的威胁持续升级。PCV3属于圆环病毒科、圆环病毒属,是一种无囊膜的环状DNA病毒。PCV3基因组由编码复制酶蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)的2个ORFs组成。其中,Cap蛋白在诱导宿主特异性免疫应答过程中发挥重要作用。2015年,美国学者Palinski等在患有猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次分离鉴定了PCV3。随后,中国、巴西、意大利、韩国、泰国、西班牙、丹麦、德国、瑞典和波兰等国家,陆续报道了PCV3感染病例。<br />  2017年,何启盖等首次报道PCV3在中国猪群中存在。此后,PCV3在中国的流行情况及其遗传进化特性成为研究热点。近期发表于《Transboundary and Emerging Diseases》的论文对PCV3分子流行病学进行了系统研究。该研究对2015年~2017年来源于中国174个猪场的616份样品(患有消化道疾病样品480份、患有呼吸道疾病样品94份、健康样品42份)进行了PCR检测和基于cap基因的遗传进化分析。结果显示,PCV3阳性率为12.2 %,其中在呼吸道疾病样品中阳性率为26.6 %,在消化道疾病样品中阳性率为10.4 %。统计分析显示,PCV3感染与消化道疾病和呼吸道疾病均呈高度相关性(p&lt;0.05)。鉴定的51个PCV3毒株cap基因与PCV3参考毒株序列的核苷酸同源性为97.1 %~99.8 %。<br />  为了分析PCV3 Cap蛋白的氨基酸序列差异性,该研究将鉴定的51个PCV3毒株分别与国内、国外以及全球范围的PCV3参考毒株的Cap蛋白进行比较与分析。结果显示,该研究鉴定的51株PCV3 Cap蛋白序列中共有17个氨基酸突变位点,其中R10K、A24V、R27K、T77S、F104Y、I150L是全球范围PCV3共性的氨基酸突变位点。根据Cap蛋白A24V和R27K两个突变位点,可将51个PCV3毒株划分为PCV3a (A24和R27)、PCV3b(A24和K27)和PCV3c(V24和K27)。51个PCV3毒株Cap蛋白氨基酸突变表现为两个特征:①氨基酸突变主要位于1~30区域;②氨基酸高频突变位于8~10、24、27、77、137和150位点。进化树分析结果显示,PCV3a(29.4 %)主要在华中地区流行,PCV3b (41.2 %)主要在东北地区流行,PCV3c (29.4 %)在中国东北、华东、华南、西南、华中和华北地区均有流行。该研究提出,PCV3 Cap蛋白特定的氨基酸突变对该病毒基因分型有一定意义。<br />  该研究揭示了2015年~2017年中国部分地区PCV3感染情况及其遗传演化特征,证实了PCV3呈现较高的感染率和遗传多样性,并与猪消化道疾病和呼吸道疾病具有关联性,为PCV3分子流行病学等相关研究提供了有价值信息。 2019年02月15 00:00 2019年02 222 222 0